一种人用狂犬病疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人用狂犬病疫苗及其制备方法，特别涉及含有复合佐剂的人用狂 犬病疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是一种自然疫原性疾病，地理分布广泛，除南极州与大洋州外，全世界各大 洲均有流行。中国属于狂犬病高发国家之一，目前居世界第二位。造成人狂犬病发病的主 要原因是公众养犬量增加，而公众对狂犬病的危害认识不足，被犬咬伤者未采取正确的伤 口处理和疫苗接种等措施也是狂犬病发病的重要因素。
[0003] 抗狂犬病免疫接种是早期免疫预防医学史中的成功范例之一。早在19世纪80年 代巴斯德开创疫苗使用到现在，已发展了五代疫苗，早期为神经组织来源疫苗，第二代为禽 胚培养疫苗，第三代为细胞培养疫苗，第四代为亚单位疫苗及精制疫苗，以及正在发展的新 一代基因工程疫苗。
[0004] 疫苗佐剂在疫苗的研发中具有重要的作用。由于现代分子生物学技术和基因工程 技术及免疫学的应用，人工合成肽段、纯化的重组抗原亚单位和质粒D等新型疫苗的研宄 已取得了初步成果。尽管这些疫苗有很多优越性，然而这些疫苗普遍存在免疫原性弱，难 以诱导机体产生有效免疫应答等不足。而传统的灭活疫苗虽然具备了制作工艺简单的特 点，但仍存在灭活过程中有可能改变有效的抗原决定簇，产生的免疫应答维持时间不长，且 需要多次免疫等问题。因此需要添加佐剂以增强机体对新型疫苗和灭活疫苗的免疫应答。
[0005] CN1824302A公开了新型人用狂犬疫苗的制备方法及用途，其基本特征在于将市售 的无佐剂的人用狂犬疫苗吸附于纳米铝佐剂上，所生成的新型人用狂犬疫苗，新型人用狂 犬疫苗所采用的纳米铝佐剂的颗粒直径为1 一 999纳米，成分为氢氧化铝化合物。纳米铝 佐剂增加10 - 20倍地吸附人用狂犬疫苗，具有明显的"爆释"效应。
[0006] 此外，现有技术中还公开了使用其他类型复合佐剂，但这些狂犬病疫苗免疫应答 时间较长，而且免疫持久水平也较低，接种后不能及时产生有效保护水平的中和抗体，致使 不能快速治疗疾病。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术不足，本发明提供一种人用狂犬病疫苗及其制备方法，特别涉及含 有复合佐剂的人用狂犬病疫苗及其制备方法。
[0008] 为达到上述发明目的，本发明可采用以下任何一个技术方案：
[0009] 本发明一方面提供一种人用狂犬病疫苗，其特征在于：含有狂犬病毒灭活疫苗原 料和复合佐剂，其中复合佐剂由氢氧化锌胶体、羊毛脂、细菌脂多糖和Tween-80组成；每剂 量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧化锌胶体〇. l-l〇mg，羊毛脂10-1000 μ g，细菌脂 多糖 1CK1000 μ g，Tween-80 10-1000 μ g〇
[0010] 每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料优选使用氢氧化锌胶体l-l〇mg，更优选 l-5mg〇
[0011] 每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料优选使用羊毛脂50-500 yg，更优选 100-300 μ g ;细菌脂多糖优选 50-500 μ g，更优选 100-300 μ g ;Tween-80 50-500 μ g，更优 选 100-300 μg〇
[0012] 本发明还提供了一种制备人用狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述方法包括如下 步骤：
[0013] (1)将葡萄糖酸锌和氢氧化钠分别配制成水溶液，在无菌条件下，将氢氧化钠溶液 缓慢滴加入葡萄糖酸锌溶液中，充分搅拌，得到氢氧化锌胶体，备用；
[0014] (2)将羊毛脂和细菌脂多糖分别配制成溶液，备用；
[0015] (3)将氢氧化锌胶体、羊毛脂溶液、细菌脂多糖溶液、Tween-80以及狂犬病毒灭活 疫苗原料混合，振荡混匀，制成人用狂犬病疫苗。
[0016] 羊毛脂是附着在羊毛上的一种分泌油脂，主要成分是留醇类、脂肪醇类和三萜烯 醇类与大约等量的脂肪酸所生成的酯，约占95%，还含有游离醇4%，并有少量的游离脂肪 酸和烃类物质。白色或浅黄色至深棕色膏状半透明体，有臭味无水物的相对密度0.946。软 化点38~44°C。酸值〈1. 0mgK0H/g。皂化值为92~106mgK0H/g。碘值约18~36mgK0H/ g。主要是高级醇类及酯类，工业品羊毛脂中酯含量约94%、游离醇4%、游离酸1 %、烃1 %。 酯中非羟基酯约占60%，羟基酯约占40% (主要为α-羟基）。
[0017] 细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分 之一，有些LPS带有毒性，感染后会产生毒性反应。这种物质对于人的免疫反应极其重要， 在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞（APC)捕获，从 而引起机体的免疫反应。脂多糖位于革兰氏阴性细菌细胞壁的外壁层，主要是一类脂多糖 类物质。它由类脂A，核心多糖和0-特异性多糖三部分组成。
[0018] Tween-80为失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚。由失水山梨醇单油酸酯与环氧乙烷 聚合而成，是一种非离子型表面活性剂。
[0019] 狂犬病毒灭活疫苗原料为市售产品。
[0020] 本发明通过优化复合佐剂和制备工艺，与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0021] 1、使用复合佐剂，大大提高免疫应答时间，快速产生中和；
[0022] 2、使用复合佐剂，免疫持续时间较长；
[0023] 3、制备工艺简单，所需设备易得，大大降低工业生产成本，得到的狂犬病疫苗的稳 定性也大大提尚。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例来对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具 体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的 所有备选方案、改进方案和等效方案。
[0025] 实施例1
[0026] 人用狂犬病疫苗由下列成分组成：每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧 化锌〇· lmg，羊毛脂10 μ g，细菌脂多糖10 μ g，Tween-80 10 μ go
[0027] 制备方法：将葡萄糖酸锌加入无菌双蒸水中，充分搅拌溶解，得葡萄糖酸锌溶液。 将氢氧化钠加入无菌双蒸水中，充分搅拌溶解，得氢氧化钠溶液。在无菌条件下，分别用封 闭式薄膜过滤器将葡萄糖酸锌溶液和氢氧化钠溶液过滤除菌后备用。中速搅拌下，将氢氧 化钠溶液缓慢滴加入葡萄糖酸锌溶液中，充分搅拌，得到氢氧化锌胶体，备用；
[0028] 将羊毛脂和细菌脂多糖分别加入到无菌双蒸水中，充分搅拌溶解，并在无菌间中 用无菌滤膜过滤器除菌，得到羊毛脂和细菌脂多糖溶液。
[0029] 将上述制备的氢氧化锌胶体、羊毛脂水溶液、细菌脂多糖水溶液、Tween-80以及狂 犬病毒灭活疫苗原料混合，振荡混匀，制成人用狂犬病疫苗。
[0030] 实施例2
[0031] 人用狂犬病疫苗由下列成分组成：每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧 化锌lmg，羊毛脂100 μ g，细菌脂多糖100 μ g，Tween-80 100 μ g〇
[0032] 制备方法：与实施例1相同。
[0033] 实施例3
[0034] 人用狂犬病疫苗由下列成分组成：每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧 化锌2mg，羊毛脂300 μ g，细菌脂多糖300 μ g，Tween-80 300 μ g〇
[0035] 制备方法：与实施例1相同。
[0036] 实施例4
[0037] 人用狂犬病疫苗由下列成分组成：每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧 化锌 〇· 5mg，羊毛脂 100 μ g，细菌脂多糖 500 μ g，Tween-80 200 μ g。
[0038] 制备方法：与实施例1相同。
[0039] 实施例5
[0040] 人用狂犬病疫苗由下列成分组成：每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧 化锌5mg，羊毛脂800 μ g，细菌脂多糖500 μ g，Tween-80 500 μ g〇
[0041] 制备方法：与实施例1相同。
[0042] 免疫试验
[0043] 对本发明的疫苗免疫情况进行试验，设试验组5组（以实施例1-5所制备的疫苗） 和对照组2组（生理盐水对照和以氢氧化铝为佐剂的疫苗）。随机在抽取56只小鼠，分为 7组，每组8只，对小鼠注射疫苗，免疫部位均为小鼠胫骨前肌。小鼠血清中抗-RABV IgG 水平的检测采用间接ELISA法。分别于初免疫后0. 5、1、2、4、8、12和16周，经尾静脉采血 0.1 ml，分离血清，以纯化灭活的RABV包被96孔板，将各实验组小鼠血清样品以初始稀释度 为1:40进行倍比稀释，详细结果见表1所示：
[0044] 表1 :小鼠初免后不同时间血清抗-RABV IgG水平
[0045]
[0046] 从表1数据可知，使用氢氧化锌胶体、羊毛脂、细菌脂多糖和Tween-80复合佐剂的 人用狂犬病疫苗可显著提高提高免疫应答时间，快速产生中和，而且免疫持续时间较长，得 到的狂犬病疫苗的稳定性也大大提高。
【主权项】
1. 一种人用狂犬病疫苗，其特征在于：含有狂犬病毒灭活疫苗原料和复合佐剂，其中 复合佐剂由氢氧化锌胶体、羊毛脂、细菌脂多糖和Tween-80组成；每剂量所述的狂犬病毒 灭活疫苗原料使用氢氧化锌胶体〇.l-l〇mg，羊毛脂10-1000yg，细菌脂多糖10-1000yg， Tween-8010-1000ug〇2. 如权利要求1所述的人用狂犬病疫苗，其特征在于每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗 原料使用氢氧化锌胶体l-l〇mg，优选l_5mg。3. 如权利要求1所述的人用狂犬病疫苗，其特征在于每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗 原料使用羊毛脂50-500yg，优选100-300yg;细菌脂多糖50-500yg，优选100-300yg; Tween-8050-500ug。4. 一种制备如权利要求1所述人用狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述方法包括如下 步骤： (1) 将葡萄糖酸锌和氢氧化钠分别配制成溶液，在无菌条件下，将氢氧化钠溶液缓慢滴 加入葡萄糖酸锌溶液中，充分搅拌，得到氢氧化锌胶体，备用； (2) 将羊毛脂和细菌脂多糖分别配制成溶液，备用； (3) 将氢氧化锌胶体、羊毛脂溶液、细菌脂多糖溶液、Tween-80以及狂犬病毒灭活疫苗 原料混合，振荡混匀，制成人用狂犬病疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种人用狂犬病疫苗，其特征在于：含有狂犬病毒灭活疫苗原料和复合佐剂，其中复合佐剂由氢氧化锌胶体、羊毛脂、细菌脂多糖和Tween-80组成；每剂量所述的狂犬病毒灭活疫苗原料使用氢氧化锌胶体0.1-10mg，羊毛脂10-1000μg，细菌脂多糖10-1000μg，Tween-8010-1000μg。采用本发明的复合佐剂，大大提高免疫应答时间，快速产生中和，免疫持续时间较长，而且制备工艺简单，所需设备易得，大大降低工业生产成本，得到的狂犬病疫苗的稳定性也大大提高。
【IPC分类】A61K39/205, A61K39/39, A61P31/14
【公开号】CN104922667
【申请号】CN201510405542
【发明人】胡德东
【申请人】宁波荣安生物药业有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月9日