ces for detecting distant relationships (蛋白进化变化模型一用于检测疏远关系的矩阵）.于Dayhoff，M. 0·(编辑）Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白序列和结构图集），National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, 345-358 页；Hein J. (1990) Unif ied Approach to Alignment and Phylogenes (比对和种系发生的统一方 法）626-645 页 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc. , San Diego, CA ； Higgins,D.G.和 Sharp, P.M.(1989)CABI0S 5:151-153 ;Myers，E.W.和 Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17 ；Robinson, E. D. (1971)Comb. Theor 11:105 ；Santou, N. Nes, M. (1987) Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath，P.H.A.*Sokal，R.R.(1973)NumericalTaxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy(数值分类学一数值分类学的原理和实 践），Freeman Press，San Francisco，CA;Wilbur，W.J.和 Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl. Acad.，Sci. USA 80:726-730。
[0113] 备选地，序列比较的最优比对可以通过Smith和Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482 的局部同一性算法，通过 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 的同一 性比对算法，通过 Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 的相似性 搜索方法，通过这些算法的计算机执行（Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group (GCG)，575Science Dr.，Madison, WI 中的 GAP, BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA)，或 通过目测来进行。
[0114] 适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和 BLAST 2.0 算法，它们分别记载在 Altschul 等（1977)Nucl.Acids Res. 25:3389-3402 和 Altschul 等（1990) J. Moh Biol. 215:403-410 中。可以使用 BLAST 和 BLAST 2.0,例如采用 本文所述的参数，来确定本发明的多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。用于进行BLAST 分析的软件可以公共地通过国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information)获得。
[0115] "同源性"是指在比对序列和引入空位（如果需要）来达到最大百分比同源性后， 多核苷酸或多肽序列变体中与非变体序列相同的残基百分比。在具体的实施方案中，多核 苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%的多核苷酸或多肽同源性。
[0116] "载体"包括穿梭和表达载体。典型地，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒的 复制和选择的复制起始点（例如，ColEl复制起始点）和选择标志物（例如，氨苄青霉素或 四环素抗性）。"表达载体"是指含有用于在细菌或真核细胞中表达抗体（包括本发明的抗 体片段）的必需控制序列或调控元件。合适的载体公开在下面。
[0117] 本发明包括包含本发明的多肽的人BMP-6抗体，包括由对应于Bmp6的多核苷酸序 列编码的那些多肽，和它们的片段和变体。在具体的实施方案中，本发明的抗体结合BMP-6 蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了结合BMP-6内的表位的BMP-6抗体，所述表位仅存 在于天然构象中，即，在细胞中表达。
[0118] 本领域技术人员要理解的是，对本文的抗体和其制备方法和其使用方法的一般描 述也适用于单个抗体多肽组成成分和抗体片段。
[0119] 本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。然而，在优选的实施方案中，它们是单 克隆的。在具体实施方案中，本发明的抗体是全人抗体。制备多克隆和单克隆抗体的方法 是本领域中已知的，并且通常记载在，例如，美国专利号6, 824, 780中。典型地，本发明的抗 体使用本领域中可获得的载体和方法通过重组方法制备，如下面进一步描述的那样。人抗 体也可以通过体外激活的B细胞生成（参见美国专利号5, 567, 610和5, 229, 275)。
[0120] 人抗体也可以在转基因动物（例如，小鼠）中制备，所述转基因动物能够在不产生 内源性免疫球蛋白的条件下产生人抗体的所有组成成分（repertoire)。例如，已经记载， 在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区（J h)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的 完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列转移至此种系突变小鼠中导致在抗原激发后产生人 抗体。参见，例如，Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ;Jakobovits 等，Nature, 362:255-258(1993) ;Bruggemann 等，Year in Immuno. ,7:33 (1993);美国专 利号 5, 545, 806, 5, 569, 825, 5, 591，669(均属于 GenPharm);美国专利号 5, 545, 807 ;和 TO 97/17852。这样的动物可以被遗传改造从而产生包含本发明的多肽的人抗体。
[0121] 在某些实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体，其包含来源于人和非人来源两者 的序列。在具体实施方案中，这些嵌合抗体是人源化的或PRIMATIZED?。在实践中，人源化 抗体典型地是人抗体，其中一些超变区残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类 似位点的残基代替。
[0122] 在本发明的背景下，嵌合抗体还包括完全的人抗体，其中保留了人超变区或一个 或多个CDR，但序列的一个或多个其他区域已经被来自非人动物的相应序列代替。
[0123] 对要用于制备嵌合抗体的非人序列（包括轻链和重链两者）的选择是很重要的， 使得当该抗体预期用于人治疗用途时减小抗原性和人抗非人抗体应答。进一步重要的是嵌 合抗体保留了对抗原的高结合亲和力和其他有利的生物特性。为了达到此目标，根据优选 的方法，通过使用亲代人和非人序列的三维模型对亲代序列和各种概念嵌合产物的分析方 法制备嵌合抗体。三维免疫球蛋白模型可普遍地获得，并且对于本领域技术人员是熟知的。 可获得说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这 些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的机能中的可能作用，即，分析影响候 选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从受体（recipient)和输入序列 中选择和组合FR残基使得实现所需的抗体特性，诸如对一种或多种靶抗原的增加的亲和 性。通常，超变区残基直接和最实质上地参与影响抗原结合。
[0124] 如上所述，抗体（或免疫球蛋白）可以基于重链的恒定区中的氨基酸序列差异分 成5种不同的类型。指定类型内的所有免疫球蛋白具有非常类似的重链恒定区。这些差异 可以通过序列研宄或更普遍地通过血清学手段（即，利用针对这些差异的抗体）来检测。本 发明的抗体或其片段可以是任何类型，并且因此可以具有γ、μ、α、δ、或 ε重链。γ链 可以是γ?、γ2、γ3或γ4;且α链可以是α 1或α 2。
[0125] 在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是IgG。IgG被认为是最通用的免疫 球蛋白，因为其能够执行免疫球蛋白分子的所有功能。IgG是血清中主要的Ig，并且是能穿 越胎盘的唯一类型的Ig。IgG也固定补体，尽管IgG4亚类不能固定。巨噬细胞、单核细胞、 PMN和一些淋巴细胞具有针对IgG的Fc区的Fc受体。并非所有亚类都同样良好地结合； IgG2和IgG4不结合Fc受体。与PMN、单核细胞和巨噬细胞上Fc受体的结合的结果是细胞 现在可以更好地内化抗原。IgG是增强吞噬作用的一种调理素。IgG与其他类型细胞上Fc 受体的结合导致其他功能的激活。本发明的抗体可以是任何IgG亚类。
[0126] 在另一优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是IgE。IgE是最不常见的血清 Ig，因为其与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的Fc受体非常紧密地结合，甚至在与抗原相互作 用之前。作为其与嗜碱性粒细胞和肥大细胞结合的结果，IgE参与变态反应。变应原与细 胞上的IgE结合导致多种药理学介质的释放，引起变态反应症状。IgE还在寄生虫蠕虫疾病 中发挥作用。嗜酸性粒细胞具有针对IgE的Fc受体，并且嗜酸性粒细胞与IgE包被的蠕虫 结合导致杀死寄生虫。IgE不固定补体。
[0127] 在多种实施方案中，本发明的抗体及其片段包含可变轻链，所述可变轻链是κ或 λ。λ链可以是任何亚型，包括，例如，λ?、λ2、λ3和入4。
[0128] 如上所述，本发明进一步提供了包含本发明的多肽的抗体片段。在某些情况下，使 用抗体片段而非整个抗体是有利的。例如，较小尺寸的片段能够被快速清除，并且可以改善 对某些组织，诸如实体瘤的可达性。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段； 双抗体；线性抗体；单链抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0129] 对于抗体片段的制备已经开发了许多技术。传统地，这些片段经完整抗体的蛋白 水解消化来获得（参见。例如，Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992);和 fcennan 等，Science, 229:81(1985))。然而，这些片段现 在可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段所有均可以在大肠杆菌中表 达并被分泌，由此能够轻易地制备大量的这些片段。Fab' -SH片段可以直接从大肠杆菌中回 收并被化学偶联以形成 F(ab'）2片段（Carter 等，Bio/TechnologylO: 163-167(1992))。根 据另一方式，F(ab'）2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。具有增加的体内半衰期 的包含补救受体（salvage receptor)结合表位残基的Fab和F(ab'）2片段记载在美国专 利号5, 869, 046中。用于制备抗体片段的其他技术对专业技术人员来说是显而易见的。
[0130] 在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段（scFv)。参见W093/16185 ;美国 专利号5, 571，894 ;和5, 587, 458。Fv和sFv是仅有的具有完整的结合位点（combining sites)的物种，它们不含有恒定区。因此，它们适合于在体内应用期间减少非特异性结 合。sFv融合蛋白可以被构建为产生效应器蛋白在sFv的氨基或羧基末端处融合。参见 Antibody Engineering(抗体工程），编辑，Borrebaeck,见上。抗体片段还可以是"线性抗 体"，例如，如美国专利号5, 641，870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特 异性的。本发明的抗体还包括单链抗体。
[0131] 本文所述的抗体考虑进行一个或多个氨基酸序列修饰作用。例如，其可能期望用 来改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适宜 的核苷酸变化引入至编码抗体的多核苷酸或其链中，或通过肽合成来制备。这样的修饰作 用包括，例如，抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或置换。可以作出缺失、插 入和置换的任何组合以获得最终的抗体，条件是最终的构建体拥有所需的特性。氨基酸改 变也可以改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。对本发明的多肽的 上述任一种变化和修饰均可以包含在本发明的抗体中。一种用于鉴定抗体中为优选的诱 变位置的某些残基或区域的有用方法称为"丙氨酸扫描诱变"，如Cunningham和Wells在 Science, 244:1081-1085(1989)中所述。
[0132] 还提供了鉴定与BMP-6结合和/或交叉阻断可溶性HJV. Fc或本文所述的示例性 抗体和/或抑制BMP-6活性的抗体或特异性结合剂的方法。这样的方法可以利用本文提供 的高度纯化的生物活性的人BMP-6 (通过化学合成或在细菌或非哺乳动物细胞中制备）的 组合物。
[0133] 抗体或特异性结合剂可以通过本领域中已知的方法筛选结合亲和力。例如，可以 使用凝胶迀移测定（gel-shift assay)、Western印迹、放射性标记竞争测定、通过色谱法共 分级（co-fractionation)、共沉淀、交联、ELISA等，它们记载在，例如，Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学技术）（1999) John Wiley&Sons, NY中，其全部内容 通过引用合并入本文中。
[0134] 为了初步地筛选与靶抗原上的期望表位结合的抗体或特异性结合剂，可以进行 常规的交叉阻断测定诸如Antibodies, A Laboratory Manual (抗体，实验室指南），Cold Spring Harbor Laboratory,编辑，Harlow 和 David Lane (1988)中所描述的测定。也可以 使用常规的竞争结合测定，其中未知抗体通过其抑制靶标与本发明的靶标特异性抗体的结 合的能力来表征。可以使用完整抗原，其片段诸如细胞外结构域，或线性表位。表位作图记 载在 Champe 等，J. Biol. Chem. 270:1388-1394(1995)中。
[0135] 在体外结合测定的一种变化形式中，本发明提供了一种方法，包括（a)使固定化 的BMP-6与候选抗体或特异性结合剂接触，和（b)检测所述候选抗体或特异性结合剂与 BMP-6的结合。在备选的实施方案中，候选抗体或特异性结合剂被固定并且检测BMP-6的结 合。使用本领域中公知的任一种方法来实现固定化，包括与载体、珠子或色谱用树脂的共价 结合，以及非共价的高亲和性相互作用诸如抗体结合，或利用链霉抗生物素蛋白/生物素 结合，其中固定化的化合物包括生物素部分。结合的检测可以如下实现：（i)利用未被固定 化的化合物上的放射性标记，（ii)利用非被固定化的化合物上的荧光标记，（iii)利用对 未被固定化的化合物免疫特异的抗体，（iv)利用未被固定化的化合物上的标记，所述标记 激发结合固定化化合物的荧光载体，以及本领域中熟知的和常规采用的其他技术。
[0136] 在一些实施方案中，抑制或中和人BMP-6活性的抗体或特异性结合剂可以通过如 下来鉴定：使BMP-6与抗体（或特异性结合剂）接触，比较在存在和缺少测试抗体（或特异 性结合剂）的条件下的BMP-6活性，并测定抗体（或特异性结合剂）的存在是否降低BMP-6 的活性。特定抗体，或特异性结合剂，或者抗体或特异性结合剂的组合的生物活性可以使用 合适的动物模型在体内评价，所述动物模型包括本文所述的任一种。
[0137] 在具体实施方案中，本发明的抗体是拮抗剂抗体，其部分或完全地阻断或抑制其 特异性或优先结合的多肽或细胞的生物活性。在其他实施方案中，本发明的抗体是生长抑 制性抗体，其部分或完全地阻断或抑制其结合的被感染细胞的生长。在另一个实施方案中， 本发明的抗体诱导凋亡。还在另一个实施方案中，本发明的抗体诱导或促进抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。
[0138] 血幼素（也称为RGMc)是蛋白质的排斥导向分子（Repulsive Guidance Molecule)家族的成员，包括RGMa和DRAGON (RGMb)，它们共享50-60 %氨基酸同一性 (Samad, T. A.，等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036)。象血幼素一样，RGMa (Babitt, J. L·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:29820-29827)和 DRAGON(Samad，T.A·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:14122-14129)也起BMP信号传导途径的共同受体的作用。
[0139] 其他BMP抑制剂可以作为由于铁调素过量引起的贫血的潜在疗法起作用。测 试纯化的与人免疫球蛋白Fc的Fc部分融合的可溶性DRAGON (DRAGON. Fe)是否以类 似于HJV. Fc的方式抑制BMP对铁调素表达的诱导（Babitt, J. L.，等2007. J Clin Invest. 117:1933-1939)。！fep3B细胞用铁调素启动子萤火虫荧光素酶报告分子和对照 Renilla荧光素酶载体转染。细胞用多种BMP配体刺激，单独地或与增加浓度的DRAGON. Fe组合。如图IA中所示，DRAGON. Fe显著地抑制响应于BMP-2和BMP-4的铁调素启动子 诱导，但对BMP-5、BMP-6和BMP-7的抑制不太有效，并且不抑制BMP-9。与HJV. Fc相比较， DRAGON. Fc显著地更有效地针对BMP-2 (图1B)和BMP-4 (图1C)，但针对BMP-6不太有效 (图1D)。DRAGON. Fc还抑制肝细胞瘤来源的H印G2细胞中的内源性铁调素 mRNA表达，而基 础铁调素表达部分地依赖于内源性BMP-2、BMP-4和BMP-6配体（数据未显示；Babitt, J. L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939)〇
[0140] 测试DRAGON. Fe在小鼠中的施用是否影响铁调素表达和铁代谢。与假处理的对照 小鼠相比，DRAGON. Fe对肝脏铁调素表达（如通过定量实时RT-PCR测量（图2A))、脾膜铁 转运蛋白表达（如通过Western印迹测量（图2B))、血清铁（图2C)、血清转铁蛋白饱和度 (图2D)、肝脏铁含量（图2E)或脾铁含量（图2F)均没有作用。与假处理的对照小鼠相 比，等同剂量的HJV. Fc减少肝脏铁调素表达（图2A)、增加脾膜铁转运蛋白表达（图2B)、 增加血清铁（图2C)和转铁蛋白饱和度（图2D)、增加肝脏铁含量（图2E)和减少脾铁含 量（图2F)。为了确认在用DRAGON. Fc蛋白注射的小鼠的血清中存在足以抑制BMP-2的活 性DRAGON. Fc，我们测试了来自这些小鼠的血清抑制BMP-2对铁调素启动子活性的诱导的 能力，如通过荧光素酶测定所测量。来自假处理的对照小鼠的血清抑制BMP-2对铁调素启 动子活性的诱导达约30% (图2G，比较柱3和2)，可能的原因是存在已知的分泌的BMP抑 制剂诸如Noggin (23)。与来自假处理的对照小鼠的血清相比，来自DRAGON. Fc处理的小鼠 的血清显著地更有效，其抑制BMP-2对铁