融合免疫蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种融合免疫球蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用，属于生 物工程领域。
【背景技术】
[0002] 多发性硬化症（MS)是一类临床表现和病理改变复杂多样，病程及预后千差万别， 其病程中常有缓解复发的神经系统损害症状。MS是以中枢神经系统白质散在/多灶性髓鞘 脱失为主要病理变化，可伴有不同程度轴索损伤的炎性自身免疫性疾病。脱髓鞘病灶于脑 白质小静脉和侧脑室周围常见，伴随淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润，免疫荧光检查可见IgG 鞘内沉积，提示有免疫激活现象。根据少突胶质细胞保留的程度、丢失的髓鞘蛋白、炎症细 胞浸润类型、免疫球蛋白或补体沉积情况可将髓鞘脱失或少突胶质细胞损伤模式分成四种 类型：（I) T细胞/巨噬细胞介导的髓鞘脱失；（2)抗体/补体介导的髓鞘脱失；（3)少突胶 质细胞营养不良并伴有少突胶质细胞凋亡；(4)原发性少突胶质细胞变性，特征与病毒感 染或中毒所致的少突胶质细胞损害类似。由此可见，MS/EAE(EAE指实验性变态反应性脑脊 髓炎）的免疫病理过程包括两个方面，一是周围免疫系统的激活，二是免疫反应在中枢神 经系统的持续存在并被放大。传统观点认为，中枢神经系统以髓鞘脱失为主的损伤主要是 由强致炎细胞因子γ干扰素（IFN-γ)介导，IFN-Y通过诱导Thl型细胞（辅助性T细胞） 分化引发针对髓鞘的免疫应答；然而在进行IFN-γ或其受体基因敲除动物研宄时，却发现 EAE仍能发生，甚至实验动物更易患病，说明MS/EAE可能是多种机制共同作用引起的自身 免疫性疾病；其中可能涉及固有免疫、特异性免疫应答和免疫应答调节机制等诸多方面。有 大量研宄结果认为，EAE模型发病机制中，Thl/Th2型细胞反应失衡，Treg细胞（调节性T 细胞）分化受阻或功能减弱是最重要的两个因素。IL_17(白介素）在EAE发病中起致炎 作用，疾病进展过程中Thl7细胞的迀移至中枢神经系统是病变部位具有高度选择性的基 础。比较认可的MS免疫应答反应过程可能包括：特异性自身反应性T淋巴细胞、B淋巴细 胞在外周首先被激活，在多种炎症介质的趋化作用下，经异常开放的血-脑屏障迀移、定位 于中枢神经系统存在髓鞘的部位并引起免疫应答。自身反应性T淋巴细胞经中枢自身髓 鞘抗原成分反复不断地刺激，通过特异性细胞毒性作用或趋化诱导单核巨噬细胞和小胶质 细胞等其他免疫细胞激活并释放多种炎性细胞因子，共同对中枢神经系统髓鞘进行直接攻 击损害。其中自身反应性CD4+Thl淋巴细胞及其释放的细胞因子被认为起主导作用，同时 B细胞来源的抗髓鞘成分抗体经由补体激活途径，趋化各种炎性细胞，并刺激针对髓鞘的调 理作用而产生免疫损伤。之后由于髓鞘自身抗原持续存在，以上免疫应答过程迀延往复，髓 鞘反复出现损伤和再生修复，临床症状随之出现特征性的缓解-复发进程。
[0003] 实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE)，是发生于各种敏感实验动物中枢神经系统的 炎性变态反应性疾病。诱导EAE模型抗原一般为组成髓鞘的成分蛋白，可通过注射特定的 全髓鞘成分蛋白或其表达强抗原性表位的某一肽段加完全弗氏佐剂（CFA)主动免疫；也可 以通过经髓鞘蛋白或其肽段致敏的CD4+T细胞过继免疫实验动物诱导。其中髓鞘成分蛋白 或其肽段作为抗原，CFA中的所含的结核杆菌，是模型诱导的一个重要因素，可直接影响模 型的发病率，甚至发病形式。CFA还可以诱导ThO细胞向Thl细胞分化而辅助免疫诱导，没有 CFA的辅助作用，一般不能被诱导出EAE模型。另外，百日咳毒素可以提高正常血-脑屏障 的通透性，有利于活化的自身反应性淋巴细胞向中枢神经系统迀移、浸润，引起炎症反应扩 散。诱导发病过程中，树突状细胞为主的抗原提呈细胞（APC)被活化并将髓鞘蛋白抗原提 呈给初始T淋巴细胞，特异性的自身反应性T淋巴细胞因此在外周被激活，穿过通透性增加 的血脑屏障迀移至中枢神经系统（CNS)。进入CNS后，T淋巴细胞通过释放炎性介质和细胞 因子等途径招募炎性细胞至CNS，由于CNS中存在同源髓鞘蛋白抗原而被本地APC再活化， 增殖并释放炎性介质，并浸润递呈主组织相容性复合基因 MHC II-抗原肽复合物的APC，导 致炎症发生，进而出现脱髓鞘及轴突受损。EAE模型动物大多数表现为加重-自然缓解单 相病程，MBP68-86肽段在诱导Lewis大鼠 EAE模型时一般发病率很高，而且疾病严重程度较 均一，变异很小；但是该模型主要表现为急性炎性反应反应，中枢神经系统血管周围的炎细 胞以中性粒细胞和单核细胞为主，少有淋巴细胞浸润；缺乏缓解-复发的临床特征，也没有 髓鞘脱失和再生修复的病理学变化。PLP139-151肽段可诱导S几小鼠复发-缓解型EAE， MOG35-55肽段可在C57BL/6小鼠诱导出慢性非缓解型EAE，所见病理改变与与人类MS极为 相似。一般而言，血清各种抗髓鞘成分或非成分抗体不能诱导出EAE模型，但利用致敏T淋 巴细胞被动传递则能成功，提示EAE/MS病变发生的本质可能属于细胞免疫机制。现在认为 其他各种抗髓鞘成分自身抗体在EAE中不具有致病性，只有抗少突胶质细胞糖蛋白（MOG) 抗体可能与疾病的发生有关。MOG是一种26-28KDa跨膜糖蛋白，表达在髓鞘膜和少突胶质 细胞外表面，其胞外区有三个可供识别的抗原表位，M0G35-55肽段是MOG胞外区致脑炎抗 原表位之一，由于MOG选择性表达于成熟少突胶质细胞髓鞘外表面，因此更易受到免疫细 胞直接攻击。近年来MOG作为EAE模型的诱导抗原已被广泛应用于动物实验研宄中，文献 报道MOG诱导C57BL/6小鼠的EAE模型表现为两种形式，慢性进展型和慢性非缓解型，在病 理和临床表现上最接近于人类MS。还有研宄结果证明MOG是髓鞘组成蛋白中唯一的既能 引起T细胞反应又能引起髓鞘抗体产生的自身抗原；这也间接显示出MOG在诱导EAE模型 建立及病理特点中的优势。C57BL/6小鼠是一种常用实验小鼠，国内较易获得和饲养，且遗 传背景清楚。M0G35-55肽段诱导C57BL/6小鼠的慢性EAE模型比急性EAE模型在临床、生 化、免疫及病理等诸多方面与MS具有更相似的特征，尽管M0G35-55肽段诱导的EAE模型还 不能完全真实地表现出人类MS全部病理特点，但仍是当前公认的研宄MS的发病机制和治 疗策略的理想动物模型之一。
[0004] 目前MS的治疗主要是缓解症状，尚没有治愈的方法，临床上用于治疗MS的一线药 物有甲泼尼龙（糖皮质激素）、β干扰素（IFN-β)等。甲泼尼龙是目前治疗MS急性期的 首选药物，疗效较为确切，它能够抑制免疫细胞DNA的合成和有丝分裂，促进血脑屏障的恢 复、改善轴索传导、诱导T淋巴细胞凋亡、减少炎性细胞因子的释放、对免疫系统的多个环 节均有强力抑制作用。但是甲泼尼龙具有广泛而严重的毒副作用，患者的耐受性差异较大， 难以长期使用，停药后的反弹现象也经常出现。而IFN-β则因价格昂贵限制其广泛使用。 这些限制促使研宄者一直努力寻找一种更加有效、特异性更高并且毒副作用低的药物替代 或联合治疗MS。
[0005] 近年来的动物实验和临床研宄都显示，B淋巴细胞可能参与MS/EAE发生和发展的 诸多环节。近年来多种单克隆抗体投入临床治疗并取得确切效果，这些现象也佐证了体液 免疫的作用可能被人们所忽视。有些研宄认为，MS患者不同的临床类型和对药物治疗反应 的高异质性可能与不同的免疫应答机制参与有关。因此，B淋巴细胞及其产生的多种抗体在 MS/EAE病程中所起的作用越来越受到人们关注。在所有髓鞘蛋白成分中，少突胶质细胞糖 蛋白（MOG)是唯一能够引起T细胞免疫和产生自身抗体的自身抗原。可以通过活化自身杀 伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞的Fc受体发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，或者形成 膜免疫攻击复合物。MS/EAE中B淋巴细胞活化可能通过三条途径：旁路活化、分子模拟和表 位扩展。MS患者确定有体液免疫学异常，即在体内可以检测到多种自身抗体，脑脊液中也存 在寡克隆带，只是还不了解寡克隆带的特异性靶抗原。Owens等对MS患者脑脊液的研宄发 现寡克隆带对已知髓鞘组成成分蛋白如M0G，髓鞘碱性蛋白（MBP)，蛋白脂蛋白（PLP)等并 不具有靶向性，这提示MS患者体内可能存在B淋巴细胞的表位扩展现象。有研宄发现，EAE 中产生的抗体所针对的抗原表位与T淋巴细胞结合的抗原表位在很大程度上是重合的，表 明T淋巴细胞和B淋巴细胞可以通过结合相同的自身抗原而发生协同作用，这种T-B淋巴 细胞之间的相互作用可能是EAE的关键发病机制之一。以上事实都说明，抑制B淋巴细胞活 化产生抗体及其抗原提呈功能，封闭自身抗体的活性是MS/EAE治疗可供选择的方法之一