专利名称：：多发性硬化症治疗和诊断的制作方法多发性硬化症治疗和诊断本发明涉及神经炎性疾病，特别是多发性硬化症的治疗和诊断。多发性硬化症是一种具有明显炎性组分的疾病。Core2GlcNAc-T酶参与支链、O-连接低聚糖的合成。Core2GlcNAc-T-EC2.41.102也被称为UDP-GlcNAc:Gal|31,3GalNAc-R(GIcNAc至GaINAc)卩-l,6-N-乙酰基葡^,移酶或Core2卩-1,6N-乙酰基氨基转移酶。虽然这种酶已被发现与炎症相^(WO0031109),QrlacchioA等((1997)JNeurolScL22;151(2):177-83)公开了Core2GlcNAc-T的活性7K平在复发的忽重忽轻的和进行性的多发性硬化症的患者的单核细胞内减少了。本发明人现在惊奇地检测到Core2GlcNAc-T活性事实上在取自多发性硬化症病人的样品的含有外周血单核细胞(PBMNC)和多形核白细胞(PMN)白细胞的白细胞制剂中显著升高。已发现以Core2为基础的低聚糖是被认为用于调节炎性应答的细胞粘着方面的蛋白质配体的一个组分，这也暗示了多发性硬化症组织中增高的白细胞渗入度。因为升高的Core2GlcNAc-T有助于增加白细胞的粘着，本发明人已经检测到在多发性硬化症的病人体内斷氐Core2GlcNAc-T的活性应该利于白细胞粘着正常化，减少白细胞外渗和减少神经炎症和相关的噬斑。因此，本发明的第一方面是提供一种治疗个体多发性硬化症的方法，所述方》雄括给与需要治疗的个体治疗有效量的育^I多陶氏Core2GlcNAoT活性的化合物。iM地该化合物可用于降低Core2GlcNAc-T的活性至正常或接近正常的水平。可通过多种途径降低Core2GlcNAc-T的活性，例如通过抑制Core2GlcNAc-T基因的转录，通过抑制Core2GlcNAc-TmRNA的转化，通过抑制蛋白质的翻译后修饰(如通过蛋白质激WP制蛋白质磷酸化从而抑制它的活化)^M31抑制酶的活性。Core2GlcNAc-T酶活性抑制剂和Core2GlcNAc-T经蛋白激酶C活化抑制剂均已知。Core2GlcNAc-T酶活性水平可方便iWl抑制酶或抑制蛋白质^l酸4化来陶氐。适用于本发明的Core2GlcNAc-T抑制剂的例子是|3Gal(l—3)a(6-脱氧)GaJNAca國Bn(Kndsgaul寧1991)JBiolChem.266(27):17858~62,Kuhns等(1993)GlycoconjugateJournal10,381-394;下述活化的化合物被Toki等描述于(1994)BiochemBiophysResCommun.198(2):417-23.:Gal|31—3GaJNAca-pnp、Gal卩l—3GaJNAca-onp、GaJNAca陽pnp、GaJNAcP誦pnp、GlcNAc卩隱pnp、Gal(3-pnp、GlcNAcpl—3GaJNAca國pnp、L-Fucal—2Gal|3"pnp、GlcNAc，p、Gap—3GlcNAc|3-pn、Gap—6GlcNAc|3-pnp;描述于共同未结的申请^W005060977的甾体苷类如TrigoneosideIva、蹄F、化合物3(3卩画26-①-D-吡喃葡糖基氧基>22-羟基呋甾-5,25(27)二烯-3-基0-6-去氧-a心吡喃甘露糖基國(1—2)-0-[P-D-吡喃葡糖基-(l—4)]-l3-D-吡喃葡M1)、PardarinosideC、ShatavarinI、ShatavarinIV、三角叶薯蓣武(Deltonin)、BalanitinVI、茄解定3-0-a-l^吡喃鼠李糖蟇(1—2)-0-[(3-D-妣喃葡萄糖基-(l—4)]-l3-D-吡喃葡萄蹄、茄啶3-0-a;吡喃鼠李糖基-(1—2KMP-D-吡喃葡萄糖基(1—4)]务D-吡喃葡萄糖苷；以及尿苷二磷酸和尿苷二磷酸-N-乙酰基葡糖胺的类似物，其公开于WO0185748中。Core2GlcNAc-T的抗体可用于减少酶的活性，其合适的实例描述在Li等(1999)GlycoconjugateJournal16,555-562(1999),US5684134,WO09043662中。蛋白质激酶-Q32(PKQ32)抑制剂己知用于在糖尿病并发症中抑制Core2GIcNAc-T活化，其中己知Core2活性被提高了(Chibber等(2003)Diabetes.52(6):1519-27-此处引入作为参考)和在体外用于抑制白细胞结合于上皮细胞。抑制PKCP的3,4-二-吲哚基-吡^2,5-二lf行生物的例子可见于例如W09535294和W09517182中。PKQ32抑制剂一^Nt别的例子是Ruboxistaurin(LY333531&LY379196)。本发明的第二方面是提供育的多斷氐Core2GlcNAc-T活性的化合物在制备用于治疗多发性硬化症的药物中的用途。这些化合物的例子如在本发明的第一方面中所述。例如这些化合物是Core2GIcNAc-T抑制剂或PKQ3(特别是PKQ32)抑制剂；tt^的化合物是Core2GIcNAc-T抑制剂。本发明的第三方面是提供一种用于治疗多发性5更化症的药物组合物，其包含可降低核Core2GIcNAc-T活性的化合物和也包括药学上可接受的载体。本发明的第四方面是提供一种诊断接受体个体中多发性硬化症的方法，所述方法包括比较接受体个体的与白细胞相关的Core2GlcNAc-T活性7K平和健康非患病个体的检测到的Core2GlcNAc-T活性水平。接受体个体中Core2GlcNAc-T活性7j^平高于健康非患病个体则预示该患者患有多发性硬化症。Core2GlcNAc-T活性的测量,在分离的组织样品上进行，如活组织检查样品或血液样品。测量可方便地通过Core2GlcNAc-T测定法从分离的血细胞和特别在含有白细胞，雌基本上不含有红血细胞的制剂上进行。一个合适的使用分离于血样样品的白细胞的步骤被Chibber等公开于Diabetes49,1724-1730(2000)。特别地，与接受体个体白细胞相关的Core2GlcNAc-T活性的数值将与已粒的健康非患病人群的正常水平进行比较。本发明人已经通过Chibber寧2000)描述的方法或实施例1所描述的方法检测到从健康个体得到的白细胞制备物中的Core2GlcNAc-T活性tK平在40至1000pmol/hr/mg之间(每毫克蛋白质弓l入的低聚銜，通常在50至500pmol/hr/mg之间，从三组健颇照个体中得到的值是249±359(n=25)，334士86(11=11)和283±37(n=31)pmol/hr/mg。当血液样品中的白细胞根据上述方法进行分析时，己注意到患有多发性!S化症的个体中Core2GlcNAc-T7jC平处于健康的未患病个体的7K平的至少2倍，例如至少4倍，至少6倍和最典型至少8倍的区间内。本发明的第五方面是提供一种测定受试物质在用于治疗多发性硬化症上的$細，包括观啶该物质用于抑制Core2GlcNAc-T活性的能力，特别是与白细胞相关的活性。Core2GlcNAoT活性的抑制可方便i舰过比较弓l入测试物质的试验中获得的Core2GlcNAc-T活性水平与未引入活性物质的试验中获得的Core2GlcNAc-T活性水平决定。Core2GlcNAoT酶活性的抑制可方便i舰过包括以下步骤的方法测得:(a)在受试物质存在与不存在下，将活性Core2GlcNAc-T酶源与Core2GlcNAc-T的接受体和糖供体接触；(b)测量被转移到接受体上的糖供体的量，以及将受试物质存在下相比于受试物质不存在下的减少的转移量与Core2GlcNAc-T抑制活性联系起来。特别im和方便的是观懂存在于或衍生于白细胞，特别是多发性更化症病人的白细胞中的Core2GlcNAoT的活性。Core2GlcNAc-T活性的任何来源都可被使用，例如通过公开于WO04111196,US5658778上的重组手段生产的酶或具有可从其推倒得出的可测量的Core2GlcNAc-T活性的组织或细胞培养基或制备物，例如描述于申请人共同未结的申请PCTGB/2004/005398中的U937细胞或心脏溶解产物(引用作为参考)。糖供体和接受体的例子和分析Core2GlcNAoT活性的一般剝牛在本脉领域是公知的，如Chibber等(2000)idHindsgaul箏1991)id^Kuhns寧1993)idToki^(1994)id和Orlacchio等(1997)id。这些方法棚于本发明的第四方面时可舰弓l入如上所述的测试物质进行调整。根据本发明的测定法的其他的例子在WO0031109和申请人共同未结的申请PCTGB/2004/005398中给出。糖供体可方便地是UDP-GIcNAc，糖雜受体可方便地是阿l-3)DaGaJNac-对硝基苯酚。此处使用的名词治疗多发性硬化症包括预防性治疗和治疗存在的疾病。多发性硬化症包括例如复发險忽重忽轻，二级进行，进行性复发和初级进行性状态。其它形式包括良性，恶性，慢掛进行性和逾度掛进行性MS。包含可>Core2GlcNAc-T活性的化合物的药物，除非是天然的食品形式，将j纖无菌和或无热源提供。特别是水性药物如水性溶液或悬浮液和特别那些应用于非肠道的药物，将在无菌和无热源的水中制备。包括本发明化合物的第二个实施方案的药物可通过口腔或非肠道途径给与，包括静脉，肌内，腹膜内，皮下，经皮，气道(气雾剂)，直肠，阴道和局部(包括口腔和舌下)给与。对于口腔给药，本发明化合物通常以片剂^ia剂，以粉剂或颗粒剂，或水性溶液或悬浮液的形式提供。口服使用的片剂可包括活性组分与药学上可接受的辅料混合，例如惰性稀释剂，崩解剂，粘合剂，润滑剂，甜味剂，矫味剂，增色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳勝内和铐，磷酸钠和药，和乳糖，玉米淀敉、和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂包括，例如淀粉和胶质，润滑剂，如果存在，可为例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。如果需要，片齐阿用肠溶性包衣材料包衣，如甘油基单硬脂酸盐或甘油基二硬脂酸盐，以延长在胃肠道中的吸收。口服胶囊包括硬明胶胶囊其中活性成分与固释剂混合，和软明l^胶囊其中活性成分与水或油例如花生油液态石蜡或橄榄油混合。:M给药的制剂例如可为具有合适基质包括，如可可脂^7K杨酸酯的栓剂。适于阴道给药的制剂可为例如阴道栓剂，止血栓，乳剂，凝胶剂，糊剂，泡沫或喷雾剂，含有除活性成分之外为本领^^公认的适宜的载体。对于肌内，腹膜内，皮下和静脉使用，本发明化合物通常以无菌溶液或悬液提供，缓冲至适宜的PH和等渗。例如魏的^C性媒介物包括Ringer's溶液和等渗氯化钠。根据本发明的水性悬浮液可包括悬浮剂如纤维素衍生物，海藻,，聚乙烯吡咯烷酮和西黄蓍胶，润湿齐咖卵磷脂。月旨质体制齐吔可被4顿。魏的防腐齐抱括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲麟丙酯。本发明的Core2GlcNAc-T抑制剂也可应用于食品或饮料产品。通常Core2GlcNAc-T抑制剂的合适剂量在每天每公斤个体体重10ng至50mg的范围之间，，在100ng至10mg区域，更，lpg至1.0mg/kg/天。理想的剂量，每天给与一次。这些具体剂量可以单位剂型给与，例如，每单位剂型中含有10昭至1500mg,优选100昭至1000mg，最，lmg至700mg活性组分。本发明参考于下述非限制性的实施例、方案和附图可被进一步公开。就此可知落于本发明范围内的进一步的实案对本领域技术人员是可预知的。附1是说明来于健細照个体和新会断为MS的个体的白细胞中的Core2GlcNAc-T活性水平的曲线图。图2以扩散图说明了图1的数据。图3a和3b说明了在不含有细胞(图3a)和以细胞为基础(图3b)的分析中纯化的trigoneosideIva、■F和shatavarinIV对Core2GlcNAc-T活性的作用曲线图。使用的测试化合物的最终浓度为20ng/ml。TWa=TrigoneosideIva，GIy國F=,F，SfflV=ShatavarinIV。实施例实施例1.分离于新诊断为MS的患者的白细胞中的Core2GlcNAc-T活性、从4个新诊断为活跃MS的病人和2个年龄匹配的健fet照个体中采取血液样品并置于肝素化试管中。血液样品在等体积的Histo"Paque1077TM(Sigma,Poole,DoreetUK)上进行分层。在40g离心30辦中。在磷酸缓冲盐水中冲洗血沉棕黄层(含有外周血单核细胞(PBMNC)和多形核白细胞(PMN)白细胞)。冷冻分离的白细胞并^#解于0.9%NaCl0.4%Triton-XIOOImMPMSF，分析Core2GlcNAc-T。反应在50mmol/12(N-吗啉代)2(N-吗啉代)乙磺酸pH7.0;1mmo1/1UDPGIcNAc,0.5pCiUDP-6[3H]-N-乙酰基葡糖胺(16,000dpm/nmol,NENLifeScienceProducts,Hounslow,U.K〕；0.1mol/1GIcNAc;1mmol/1(3Gal(l-3)DaGaJNac-对硝基苯酚禾口15pi细胞溶解产物(l00-200昭蛋白质)中进行，最终体积为30Ml。将混合物在37。C培养1小时后，加入lml冰水终止反应糊C18Sep-Pak柱鹏(Watere画廳pore,Watfo喊U.K.)。用20mlzK冲洗柱子之后，产品用5ml甲酉激脱并且计数方謝性。Core2转移酶的内源活性在不加入添加的接受体时进行测量。结果见图1和2。2.i!3iCore2GlcNAc-T抑制剂抑制Core2GlcNAc-T的活性2a细胞基础微在受试物质存在和不存在的情况下将人类白细胞(U937细胞)暴露于人类重组TNF-a(8pg/ml)。经过24小时培养，Core2GlcNAc-T的活性如上进行测2b无细胞试-验在无细胞试验中来自于过度表达TNF-ot的转基因小鼠(雌性，B6.SJL"Tg(TNF)由Taconic誦M+B,Bomholtveg10,8680Ry,Denmark提供)棘自BB大鼠(FestingM.F.W(Ed).生物研究中的纯系.TheMacmillanPressLt4London(1979).ISBN0-333-23809-5)的Core2GlcNAc-T心脏溶解产物在37。C暴露于多种浓度的测试化合物l小时。Core2GlcNAc-T的活性如上进行测量。纯化于胡芦巴(fenugreek)种子的TrigoneosideIVa和糖苷F(Yoshikawa等1998Heterocycles47,397405)禾口ShatavarinIV(Ravikumar等1987IndianJ.Chem.26B，1012-1017，Joshi和Dev1988IndianJ.Chem.27B,12-16)^t^i微中作为抑制剂被测定。表1Core2GlcNAc-T抑制剂的IC50大约值(nM)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*无细胞]^验在TNF-a小鼠的心脏溶解产物中进行衬无细胞逸验在BB大鼠的心脏溶解产物中进行a22nM时在BB大鼠心脏溶解产物中100%抑制b22nM时在BB大鼠心脏溶解产物中89%抑制c在22.5nM时检测为无活性权利要求1.能够降低Core2GlcNAc-T活性的化合物在制备用于治疗多发性硬化症的药物中的用途。2.如权利要求l所述的用途，其中育,斷氐Core2GlcNAc-T活性的化合物是Core2GlcNAoT酶活性抑制剂。3.如权利要求1或2所述的用途，其中Core2GlcNAc-T活性抑制剂选自甾体糖苷、尿苷二磷酸-N-乙酰基葡糖胺类似物、尿苷二磷酸的类似物，PGalG—3)o(6-脱氧)GalNAca-Bn以及可M3ii^自下列的化合物的UV活化而获得的化合物Gal卩l—3GaJNAca-pnp、Gap—3Ga]NAca-onp、GaJNAca-pnp、GaJNAc(3画pnp、GlcNAc卩-pnp、Galp-pnp、GlcNAc卩1—3GalNAca-pnp、L-Fucal—2Gaip-pnp、GlcNAca-pnp、Galj31—6GlcNAc卩-pnp和Gap—3GlcNAcP-p叩。4.如权利要求2或3所述的用途，其中Core2GlcNAc-T活性抑制剂是甾体蹄。5.如权利要求2至4任一项所述的用途，其中Core2GlcNAc-T活性抑制剂选自TrigoneosideIva、糖苷F、化合物3、PardarinosideC、ShatavarinI、ShatavarinIV、三角叶薯蓣甙、BalanitinVT、茄解定3-Oa-L-吡喃鼠李糖基-(1—2K>[P-D-吡喃葡萄糖基-(l—4)]-!3-D-吡喃葡萄糖苷、茄啶3-0-a-L^吡喃鼠李糖基-(1—2)-0-[卩-D-吡喃葡萄糖基(l44)]-(3-D-吡喃葡萄Mo6.权利要求1所述的用途，其中能够降低Core2GlcNAc-T活性的化是蛋白激酶Q3抑制剂。7.权利要求6所述的用途，其中能够降低Core2GlcNAc-T活性的化^t)是蛋白激酶Q32抑制剂。8.如权利要求6或7所述的用途，其中化合物选自3,4C^|Bi(^4l:n^2,5-二酾行生物。9.如权利要求6或7所述的用途，其中化合物是Ruboxistaurin。10.—种诊断受试个体中多发性硬化症的方法，所述方法包括比较从受试个体分离的样品中Core2GlcNAc-T活性7jC平与从健康非患病个体分离的样品中Core2GlcNAc-T活性zK平，从受试个体分离的样品中Core2GlcNAc-T活性水平高于从健康非患病个体分离的样品中Core2GlcNAc-T活性水平则预示该个体患有多发性硬化症。11.如权利要求10所述的方法，其中从受试个体分离的样品中Core2GlcNAc-T活性水平比从健康非患病个体分离的样品中的Core2GlcNAc-T活性水平高至少2倍预示受试者患有MS。12.—种测定物质用于治疗多发性硬化症的效用的方法，所述方法包括测定物质抑制Core2GlcNAc-T活性的會巨力。13.如权利要求12所述的方法，其中物质抑制Core2GlcNAc-T活性的能力是舰比较引入测试物质的逸验中获得的Core2GlcNAc-T活性水平与未引入活性物质的试验中获得的Core2GlcNAc-T活性水平来测量的。14.如权利要求12或13所述的方法，其中物质抑制Core2GlcNAc-T活性的能力^151包括以下步骤的方法测得(a)在受试物质雜下，将活性Core2GlcNAc-T酶源与Core2GlcNAc-T的接受体和糖供体撤虫；(b)测量被转移到接受体上的糖供体的量，和(c)在受试物质不存在的情况下进行步骤(a)和(b)以决定物质是否抑制通过Core2GlcNAc-T进行的糖供体向接受体的转移。15.—种治疗个体多发性硬化症的方法，所述方法包括给予需要的个体治疗有效量的會,斷氐Core2GlcNAc-T活性的化合物。16.—种用于治疗多发性硬化症的药物组合物，所述组合物包含能够降低Core2GlcNAoT活性的化^t)。全文摘要公开了能够降低Core2GlcNAc-T活性的化合物在制备用于治疗多发性硬化症的药物中的应用。还公开了诊断受试个体中多发性硬化症的方法，以及测定受试物质用于治疗多发性硬化症的效用的方法，包括受试物质抑制Core2GlcNAc-T活性的能力。文档编号C12Q1/48GK101262869SQ200680022584公开日2008年9月10日申请日期2006年6月22日优先权日2005年6月22日发明者R·哈根,R·奇伯申请人:英国技术集团国际有限公司