70] 如图10⑴和图10⑵所示，图10⑵中的*EAE组不同时期与对照组比较，P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; Y两治疗组与EAE组慢性维持期 比较P < 0. 05。可见⑶32b在脑内的表达在发病高峰期和慢性维持期明显增加，较对照组 均有统计学差异（P< 0.05)，提示随着病情进展，体内免疫抑制效应可以自发性调节免疫 应答的强度。经治疗后，甲泼尼龙组表达较发病高峰期无明显变化，但较慢性维持期降低且 存在统计学差异（P< 0.05);而融合蛋白治疗组变化明显，较发病高峰期和慢性维持期均 增加，统计学差异具有显著性（P < 〇. 05)。提示Fc γ RIIb在发病高峰期和慢性维持期已 经存在自发性表达增加，是机体对免疫反应调节的表现。融合蛋白可以通过增加 Fc γ RIIb 的表达发挥免疫抑制作用，甲泼尼龙的治疗作用则可能通过其他机制。
[0071] ⑵补体C3在脑内表达
[0072] 如图11 (1)和图11 (2)，图11 (2)中的*ΕΑΕ组不同时期与对照组比较，P < 0. 05 ; #两治疗组与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; Y两治疗组与EAE组慢性维持期比较 P < 0. 05。可见补体C3在脑组织中的的含量在固有免疫期有所升高，之后呈逐渐下降趋 势，至发病高峰期维持较低水平，激素治疗组补体C3水平较发病高峰期无明显变化（Ρ > 0. 05)，较慢性维持期有所升高。融合蛋白治疗组则较发病高峰期和慢性维持期补体C3含 量降低，有统计学差异（P < 〇. 05)，表明融合蛋白能够减少补体C3的生成。
[0073] (3) MHCI分子在脑内表达变化
[0074] 如图12⑴和12⑵所示，图12⑵中的*EAE组不同时期与对照组比较，P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; Y两治疗组与EAE组慢性维持期 比较P < 0. 05。脑内MHCI类分子在慢性维持期仍处于高水平表达，经过甲泼尼龙和融合蛋 白治疗后表达下降，与慢性缓解期有统计学差异（P< 0.05);说明甲泼尼龙和融合蛋白均 可以降低脑内MHCI类分子的表达。
[0075] (4)MHCII分子在脑内表达变化
[0076] 如图13⑴和13⑵所示，图13⑵中的*EAE组不同时期与对照组比较，P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; Y两治疗组与EAE组慢性维持 期比较P < 0. 05。脑内MHCII类分子同样在慢性维持期仍处于高位，表明MHCII类分子在 EAE中存在持续高表达，这与病程迀延不愈相一致。经过干预治疗后，甲泼尼龙组和融合蛋 白组均较慢性维持期含量下降，有统计学意义（P< 0.05);提示甲泼尼龙和融合蛋白都有 抑制MHCII类分子表达的作用。
[0077] (5)IL_12在脑内表达的变化
[0078] 如图14 (1)和图14⑵所示，图14⑵中的*EAE组不同时期与对照组比较，P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; Y两治疗组与EAE组慢性维持期 比较P < 0. 05。IL-12在EAE组发病高峰期时处于最高值，而后变化不明显，经甲泼尼龙和 融合蛋白治疗后下降，与EAE组高峰期和慢性维持期比较IL-12表达降低均有统计学意义 (P < 0. 05)，提示甲泼尼龙和融合蛋白都可以抑制IL-12的生成。
[0079] 实施例5 :RT-PCR结果
[0080] (1)各组小鼠不同时期TGF-β、Fas和C5a在脑内的表达变化
[0081] 如图15和表3所示，激素治疗组TGF-β脑内的表达较发病高峰期和慢性维持期 均升高，有统计学意义（P< 0.05);融合蛋白治疗组TGF-β脑内的表达与发病高峰期比 较降低，有统计学意义（P < 0.05)，与慢性维持期比较无统计学意义（P > 0.05)。激素 治疗组脑内Fas的表达降低，较发病高峰期和和慢性维持期均有统计学意义（P < 0. 05); 融合蛋白治疗组Fas的表达也有一定降低，与发病高峰期和慢性维持期有统计学差异（P < 0. 05)。C5a的表达在激素治疗组无明显降低，与发病高峰期和慢性维持期比较无统计学 差异（P> 0.05);在融合蛋白组的表达下降，与发病高峰期和慢性维持期比较有统计学意 义（P < 0· 05)。
[0082] 其中，图15中*两治疗组与EAE组发病高峰期比较P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE 组慢性维持期比较P < 0. 05。
[0083] 表3EAE组不同时期与对照组脑内TGF- β、Fas和C5a mRNA表达水平变化
[0084]
[0086] (2)各组小鼠不同时期FoxP3、IL-27和B7-1在脑内的表达变化
[0087] 如图16所示，*两治疗组与EAE组发病高峰期比较P < 0. 05 ;#两治疗组与EAE组 慢性维持期比较P < 0. 05。两治疗组都可以明显下调脑内B7-1的表达，与EAE组发病高峰 期和慢性维持期比较有统计学差异（P < 〇. 05);甲泼尼龙治疗组还可明显降低脑内IL-27 的表达，与EAE组发病高峰期和慢性维持期比较有统计学差异（P < 0. 05)，融合蛋白治疗 组的表达较发病高峰期下降，有统计学差异（P < 0. 05)，但较慢性维持期无显著差异（P > 〇. 05);两治疗组对FoxP3表达未见明显影响。
[0088] 表4 FoxP3、IL-27和B7-lmRNA在EAE组小鼠脑内的表达
[0090] 从以上5个实施例可知：融合蛋白治疗组和甲泼尼龙治疗组都具有下调脑内APC 提呈相关主要因子MHCI、MHCII类分子、B7-1的表达，降低APC分泌的活性因子IL-12、 IL-27水平，抑制单核巨噬细胞活化、增殖；减轻MBP的破坏和吞噬。融合蛋白对能够促进 APC提呈功能的补体C3和C5a的生成具有抑制作用，上调抑制性受体Fc γ RIIb的表达；表 现出对APC活化的多重阻遏作用，但未见对T淋巴细胞相关免疫应答有显著作用。即融合免 疫球蛋白可以通过抑制APC的MHC分子表达，抑制其致炎细胞因子释放而缓解慢性EAE的 神经功能损伤症状；融合免疫球蛋白具有明确的缓解慢性EAE小鼠临床功能损害的作用， 治疗过程中没有出现激素样停药反弹现象，可作为单独或联合其他药物制备治疗多发性 硬化症的药物。
【主权项】
1. 融合免疫球蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述融合免疫球蛋白是具有序列表中SEQ IDN2 :2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQIDN2 :2氨基酸残基序列经过一个或几 个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQIDN2 :2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ IDN2 :2衍生的蛋白质。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述融合免疫球蛋白是序列表中的SEQID Ns :2〇4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述融合免疫球蛋白编码基因，是下列核苷 酸序列之一： 1) 序列表中SEQIDNs: 1的DNA序列； 2) 编码序列表中SEQIDN2 :2蛋白质序列的多核苷酸； 3) 与序列表中SEQIDN2 :1限定的DNA序列具有95%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述融合免疫球蛋白编码基因是序列表中 的SEQIDNs: 1。
【专利摘要】本发明公开了融合免疫球蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用，属于生物工程领域。本发明的融合免疫球蛋白具有明确的缓解慢性EAE小鼠临床功能损害的作用，治疗过程中不会出现激素样停药反弹现象，可作为单独或联合其他药物制备治疗多发性硬化症的药物。
【IPC分类】A61P25/00, A61P37/02, A61K39/395
【公开号】CN104922670
【申请号】CN201510223676
【发明人】张蕲, 周翔鱼, 祝道成, 周雄
【申请人】武汉奥斯梅得生物医药有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月6日