例，对本发明的融合免疫蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中 的应用作进一步详细说明。
[0037] 一、实验材料：
[0038] 1、融合免疫球蛋白（专利号：CN200410006498. 9)和甲泼尼龙琥珀酸钠，甲泼尼龙 琥珀酸钠由辉瑞制药有限公司生产。
[0039] 2、168只健康8~10周龄的雌性野生型C57BL/6小鼠，体重18-22g，由武汉大学 实验动物中心提供，在室温18-25°C、相对湿度（50-60) %，人工12小时昼/夜循环照明环 境中用全价营养饲料分笼饲养，小鼠能自由摄食及饮水。适应性饲养1-2周后予以编号分 组。
[0040] 二、动物分组及模型建立：
[0041] 本研宄在设计时考虑到EAE为一种免疫系统疾病，所需检测指标大多为免疫细胞 自身表达或免疫反应过程中的产物，对于正常机体在没有免疫应答时表达较为恒定，也不 存在生理性波动周期，所以在对发病不同时期各组比对时均以对照组作为基准，不再设立 相应时间段的空白对照。
[0042] (A组）对照组：随机分出24只小鼠作为空白对照组，正常饲养，不给予任何干预。 分别再与C组相对应的时间点处死动物进行相关检测。
[0043] (C组）EAE自然病程组：随机分出72只小鼠用M0G35-55肽段及免疫佐剂制作慢 性EAE动物模型。每只小鼠分2点腹股沟皮下共注射0. 2ml混合乳剂，其中含人工合成 的M0G35-55肽段250 μ g，完全弗氏佐剂2mg，免疫0天和2天时经腹腔各注射百日咳毒素 200ng。一周后重复免疫注射一次。从免疫当天第0天起，至第42天实验终止前，每天观察 动物行为活动，采用盲法，每天2人至少一次在同一时间依据Benson评分标准做EAE临床 症状严重程度评估。分别在动物固有免疫期（免疫后3天）、发病前期（免疫后10-12天）、 发病初期（免疫后15-20天）、发病高峰期（免疫后24-28天）和慢性维持期（免疫后第 42天）以每组12只处死动物，取组织进行相关检测。未发病或死亡标本自动剔除。
[0044] (D组）糖皮质激素治疗组：随机分出36只C57BL/6小鼠，与EAE组同时制作动物 模型，未发病或死亡样本自动剔除，成功者于发病高峰期给予腹腔注射甲泼尼龙5mg/kg，每 日1次，连续治疗7天并继续观察1周评价疗效。于免疫后第42天处死动物进行相关检测。 未发病或死亡样本自动剔除。
[0045] (E组）融合蛋白治疗组：随机分出36只C57BL/6小鼠，与EAE组同时制作动物模 型，未发病或死亡样本自动剔除。制作动物模型成功小鼠于发病高峰期给予腹腔注mGE2mg/ kg，每日1次，连续治疗7天并继续观察1周评价疗效。于免疫后第42天处死动物进行相 关检测。未发病或死亡样本自动剔除。
[0046] 三、实验结果及分析：
[0047] 以下对比采用统计学处理：所有数据均以均数土标准差表示并输入SPSS 14. 0统 计软件，对照组和实验组以P < 〇. 05为差异，表示有统计学意义。
[0048] 实施例1 :实验小鼠的发病率及不同阶段平均临床评分
[0049] 本实验于第42天终止时，A组所有小鼠始终无一发病；C组C57BL/6J模型小鼠除 去发病前处死的24只小鼠，累计有41/48 (85. 4%)小鼠发病，C组于接种后15 - 20天陆 续发病，24-28天达高峰，维持5-7天之后，自然病程组部分临床症状可有缓解，临床评分相 对降低，但症状持续存在，此后进入慢性维持期，疾病呈典型的慢性非缓解性过程；D组共 有29/36(80. 5 % )只小鼠发病，E组有28/36(77. 8 % )只小鼠发病；症状表现同EAE组相 同。E组有1只小鼠在未发病时死亡，可能与注射时操作不当有关；D组无小鼠死亡。激素 治疗组在停药后有8/28(28.5 % )只小鼠发生停药后的反弹现象，表现短暂一过性瘫痪症 状加重，持续2-3天后又明显好转，这与临床使用甲泼尼龙观察到的现象相一致；融合蛋白 治疗组未见此现象。
[0050] 如表1及图1所示，在经过激素和融合免疫球蛋白治疗后，两组临床功能评分均有 明显下降，相对于EAE自然病程组具有统计学差异（P < 0. 05)，表明治疗能够缓解神经功能 的损伤程度。为剔除EAE组症状自然缓解的因素影响，实验结束时的评分对比表明，两治疗 组较EAE组慢性缓解期仍有好转，统计学有差异（P < 0. 05);但两治疗组之间没有统计学 差异（P > 0· 05)。
[0051] 表1实验小鼠的发病率及不同阶段平均临床评分（X土s)
[0053] 实验结果：（1)与EAE组发病高峰期比较，P < 0. 05 ; (2)与EAE组慢性维持期比 较，P < 0. 05。
[0054] 实施例2 :实验小鼠脑组织病理学及免疫组化改变
[0055] 经过治疗后，小鼠脑HE和LFB染色在光镜下可见到（见图2和图3)。炎性细胞 浸润较EAE组发病高峰期和慢性维持期有所好转，髓鞘脱失也有缓解。未见到由于轴索损 伤而引起的APP在局部聚集形成的异常染色。脑内小胶质细胞活化程度两治疗组均明显减 轻，甲泼尼龙治疗后几乎已恢复正常；表明甲泼尼龙和融合蛋白具有抗炎和减轻髓鞘损伤 的作用，尤以甲泼尼龙的作用更明显。
[0056] 图2中的A为对照组小鼠脑HE染色；B为EAE组小鼠固有免疫期脑HE染色；C为 EAE组小鼠发病前期脑HE染色；D为EAE组小鼠发病初期脑HE染色；E为EAE组小鼠高峰 期脑HE染色；F为EAE组小鼠慢性维持期脑HE染色。
[0057] 图3中的A为对照组脑LFB染色；B为EAE组小鼠固有免疫期脑组织LFB染色；C 为EAE组发病前期脑LFB染色；D为EAE组发病初期脑LFB染色；E为EAE组发病高峰期脑 LFB染色；F为EAE组慢性维持期脑LFB染色。
[0058] 如图4-8所示，免疫荧光组化显示，经过甲泼尼龙治疗后，小鼠脾脏内IFN-γ和脑 Fas的荧光显色较EAE组发病高峰期和慢性维持期有显著减少；经mGE治疗后显色差异不 及甲泼尼龙治疗组显著。mGE和甲泼尼龙治疗后IL-12的荧光显色均有明显减少。甲泼尼 龙和mGE治疗后均能抑制炎性细胞增殖和MBP破坏、吞·，但甲泼尼龙作用表现得更明显。 其中：
[0059] 图4中的A为EAE组发病高峰期脾脏IFN- γ免疫荧光组化；B为EAE组慢性维持 期脾脏IFN-γ免疫荧光染色；C为甲泼尼龙治疗组脾脏IFN-γ免疫荧光染色；D为融合蛋 白治疗组脾脏IFN-γ免疫荧光染色。
[0060] 图5中的A为EAE组发病高峰期脑内Fas免疫荧光染色；B为EAE组慢性维持期 脑内Fas免疫荧光染色；C为甲泼尼龙治疗组脑组织Fas免疫荧光染色；D为融合蛋白治疗 组脑组织Fas免疫荧光染色。
[0061] 图6中的A为EAE组发病高峰期脑IL-12免疫荧光染色；B为EAE组慢性维持期 脑IL-12免疫荧光染色；C为甲泼尼龙治疗组脑IL-12免疫荧光染色；D为融合蛋白治疗组 脑内IL-12免疫荧光染色。
[0062] 图7中的A为EAE组发病高峰期脑Ki-67、MBP双标免疫荧光组化；B为EAE组慢 性维持期脑Ki-67、MBP双标免疫荧光组化；C为甲泼尼龙治疗组脑组织Ki-67、MBP双标免 疫荧光组化；D为融合蛋白治疗组脑Ki-67、MBP双标免疫荧光组化。
[0063] 图8中的A为EAE组发病高峰期脑Ki-67、Ibal双标免疫荧光组化；B为EAE组慢 性维持期脑Ki-67、Ibal双标免疫荧光组化；C为甲泼尼龙治疗组脑组织Ki-67、Ibal双标 免疫荧光组化；D为融合蛋白治疗组脑Ki-67、Ibal双标免疫荧光组化。
[0064] 实施例3 :血-脑屏障通透性变化
[0065] 如图9和表2所示，自EAE组发病高峰期和慢性维持期始终保持高水平，经融合 免疫球蛋白治疗后未观察到明显变化，较发病高峰期和慢性维持期无统计学差异（P > 0. 05)，甲泼尼龙组血-脑屏障通透性有所降低，较EAE组有统计学差异（P < 0. 05 ;表明甲 泼尼龙对血-脑屏障通透性升高有抑制作用，而融合免疫球蛋白未显示出此作用。
[0066] 表2实验小鼠海马组织内EB含量（μ g/g脑组织）的变化
[0068] 实施例 4 :Werstern_Blot 结果
[0069] (I)Fcy RIIb (CD-32b)在脑内的表达
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