2. 3、试验组合1~4含药血清的制备
[0045] Wistar大鼠，体重300g左右，随机分为5组，含药血清1组、含药血清2组、含药血 清3组、含药血清4组和正常组。含药血清1~4组给予药液12. lg/kg. d罐胃，正常组给 予等体积的生理盐水，每日2次，连续3d，于末次灌药前12h禁食。第4天早晨末次灌药后 lh，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，室温静置4h后，3000r/min离心15min，分 离血清，经56°C、30min灭活处理后，-70°C冰箱保存备用。
[0046] 2.4、荧光定量PCR检测RPMVECs中ICAM的mRNA水平
[0047] 原代培养RPMVECs，设置正常组、病毒组、病毒+试验1组、病毒+试验2组、病毒+ 试验3组、病毒+试验4组、TNF-a组、TNF-a+试验1组、TNF-a+试验2组、TNF-a+试验3 组、TNF-a+试验4组（上述各组病毒最终滴度为100TCID50, TNF-a最终浓度100ug/L，试验 1~4组浓度对应表1各组）。干预因素作用24小时后，收集各组细胞、按照RNeasy Mini Kit试剂盒操作说明书提取各组细胞总RNA，用TE缓冲液10倍稀释。PCR扩增按One Step SYBR Prime Script PT-PCR kit II试剂盒说明书进行。扩增条件为：Pattern l:42°C5min; 95°C 10s ;Pattern2 :循环40,95°C 5s，60°C 30s，测得Ct值。结果以目的基因与内参基因的 比值表示。
[0048] 2. 5流式细胞术检测ICAM蛋白的表达
[0049]原代培养RPMVECs，分组同2. 4。干预因素作用24小时，消化细胞，4°C、1000r/min 离心5min，弃上清，PBS溶液洗绦3次后，PE标记的ICAM孵育30min，4°C、1000r/min离心 5min，弃上清，再用PBS溶液洗涤3次后，4%多聚甲醛固定，流式细胞术检测平均荧光强度。
[0050] 3、统计学处理
[0051] 数据采用SPSS16. 0软件分析。数据以均数土标准差（mean土SD)表示。多组间 差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA)，组间两两比较用LSD法，以p < 0. 05为差异有 统计学意义。
[0052] 4、结果
[0053] 4. 1、各试验组合对鼻粘膜中ICAM表达的影响
[0054] 感染后第6天各鼻粘膜组织ICAM的免疫组化染色见图1，模型组鼻粘膜组织中 ICAM表达明显增多，与正常组相比差异显著（P<0.01)。试验组1~2粘附分子的表达在 各个时点均低于模型组，差异显著（P < 〇. 01)，试验组3~4粘附分子的表达在各个时点也 均低于模型组，但是无显著差异（P > 0. 05)，见图2。
[0055] 4. 2、Real-time PCR 检测流感病毒感染的 RPMVECs 中 ICAM mRNA 水平
[0056] 流感病毒感染RPMVECs 24小时后，病毒组ICAM mRNA表达明显增多，与正常组相 比有显著差异（P < 0. 01)，病毒加试验组1~4含药血清组粘附分子mRNA的表达低于模 型组，其中1~2组差异显著（P < 0. 01)，3~4组无显著差异（P > 0. 05) ;TNF-a组ICAM 表达明显增多，与正常组相比差异显著（P < 0. 01)，TNF-a加试验组1~4含药血清粘附分 子mRNA的表达低于TNF-a组，其中1~2组差异显著（P < 0. 01)，3~4组无显著差异（P > 〇? 05)，见图 3。
[0057] 4. 3、流式细胞术检测流感病毒感染的RPMVECs中ICAM蛋白的表达
[0058] 干预因素作用24小时，与正常组比较，病毒组和TNF-a组RPMVECs的ICAM表达升 高，均有显著差异（P< 0.01);与病毒组相比，病毒加含药血清组ICAM表达降低，且均有显 著差异（P < 〇. 01);与TNF-a组相比，TNF-a加试验组1~4含药血清组ICAM表达降低，其 中1~2组差异显著（P < 0. 01)，3~4组无显著差异（P > 0. 05)，见表2。
[0059] 表2试验组1~4对流感病毒感染的RPMVECs中ICAM蛋白表达的影响.
[0061] 5、结论
[0062] 研宄结果显示：聚山梨酯和吡咯烷酮羧酸钠组合对鼻粘膜ICAM分子的表达在各 个时点均低于模型组，且具有显著差异，然而单独使用聚山梨酯和吡咯烷酮羧酸钠虽然也 低于模型组，但是不具有显著差异，证实了聚山梨酯和吡咯烷酮羧酸钠组合能抑制因流感 病毒引起的鼻粘膜ICAM的升高，也能降低TNF-a所致ICAM表达的升高。这说明了聚山梨 酯和吡咯烷酮羧酸钠能抑制感冒病毒在鼻粘膜中ICAM受体结合，从而缩短感冒病程。
[0063] 二、本发明人造鼻粘膜凝胶防止流感病毒在鼻粘膜中滋生的试验。
[0064] 1、材料
[0065] 1. 1、细胞与病毒：幼犬肾（MDCK)细胞、H2N3流感病毒由目前流行的甲型H2N3流 感病例中分离鉴定并保存。细胞增殖培养基：含10%小牛血清的杜尔贝改良的伊格尔培养 基（DMEM)，青霉素、链霉素含量为100u/ml。无血清培养基1 :含青霉素、链霉素100u/ml的 DMEM培养基。无血清培养基2 :含青霉素、链霉素100u/ml，胰蛋白酶2ug/ml的DMEM培养 基。
[0066] 1. 2、其他材料：DMEM、小牛血清、噻唑蓝、二甲基亚砜。1%鸡红细胞悬液。
[0067] 2、方法
[0068] 2. 1、组合物对细胞毒性试验
[0069] 用无血清培养基2将聚山梨酯和吡咯烷酮羧酸钾稀释成不同浓度含药维持液，加 入单层MDCK细胞96孔培养板中，同时设细胞对照，溶液对早，每个浓度重复4孔。观察细 胞形态变化，72小时后，用MTT法对活细胞染色，测吸光度A57(l值作为反映细胞存活情况的 参数，根据A值计算不同组合浓度下细胞存活率。用Probit回归法计算组合物半数毒性浓 度（TC 50)。
[0070] 2. 2、病毒滴度测定
[0071] 将病毒液用无血清培养基1稀释成不同滴度的病毒悬液，用15ug/ml胰酶预处理 后，接种于MDCK细胞上，2小时后弃去病毒液，洗涤细胞后加入无血清培养基2,同时设细胞 对照，每个滴度重复4孔。每天观察细胞形态变化，72小时后，用MTT法测细胞存活率，依据 A值计算不同病毒滴度下细胞存活率。用Probit回归法计算病毒半数组织感染量（TCID5Q)。
[0072] 2. 3、组合物抗病毒作用
[0073] 聚山梨酯、吡咯烷酮羧酸钾、聚山梨酯和吡咯烷酮羧酸钾组合物、阿比朵尔（各个 药物浓度见表3)对甲型H2N3流感病毒的作用各分为3组。
[0074] a组：先将100TCID5Q病毒液用15ug/ml胰酶预处理后，加入到MDCK细胞上吸附2 小时，再更换为不同浓度的维持液。
[0075] b组：100TCID5Q病毒液与不同浓度的维持液4°C作用6小时后，再用15ug/ml胰酶 预处理，再加入到MDCK细胞上吸附2小时，最后更换为无血清培养液2。
[0076] c组：先将不同浓度药物加入到MDCK细胞上作用6小时后，弃去药液加入经15ug/ ml胰酶预处理后的100TCID 5(I病毒液作用2小时，再更换成无血清培养基2.
[0077] a~c组每个浓度重复4孔，同时设病毒对照，正常细胞对照组和溶液对照组。 37°C、5% C02培养，每天使用显微镜观察细胞变化。待病毒对照组细胞病变效应达80%以 上，且细胞对照组正常时，用MTT对活细胞染色，读取A570吸光值，按下列公式计算药物对 病毒的抑制率；
[0078] 病毒抑制率=(药物作用组A值-病毒对照组A值）八正常细胞对照组八值-病 毒对照组A值）X100%。
[0079] 表3:各个试验组药物浓度
[0081]
[0082] 2. 4、数据处理
[0083] 各项试验均重复3次以上，分别计算各数据平均值及标准差。其中，MTT法所得的 细胞存活率和病毒抑制率，分别用Probit回归法计算药物半数毒性浓度（TC 5(I)、病毒半数 组织