一种以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物组织医学材料制备技术领域，涉及一种以牛血清白蛋白为基体单 元反相微乳液得到蛋白质水凝胶微球的方法。
【背景技术】
[0002] 局部植入组织工程生物填充材料是整形、重建外科治疗相关疾病的有效手段之 一(Ghoniem GM, Elgamasy AN, Elsergany R， et al. Grades of intrinsic spincteric deficiency (ISD) associated with female stress urinary incontinence[J]. Int Urogynecol J，2002:13(2):99-105.)。填充材料一般分成自体脂肪组织和生物材料两大 类。自体组织移植虽然是整形手术中最重要的治疗手段，但自体组织取材有限。为此，按 不同需要制作的生物医学材料作为各类组织的代用品，在临床应用中一直发挥重要作用。 目前用于实验研宄和临床治疗的软组织填充材料有聚四氟乙烯微球、戊二醛交联牛胶原蛋 白、硅树脂微球等，但是，临床应用表明上述材料多少都存在一些问题：如在体内部分吸收 (体积保持率低)、迀移、引起免疫反应、产生并发症、植入困难等；另外，部分材料的成本较 高，生物安全的问题也未得到解决（Van Kerrebroeck P，TerMeulen F, Farrelly E, et al. Treatment of stress urinary incontinence: recent developments in the role of urethral injection [J]. Urol Res, 2003 ；30(6) : 356-362 ；Su TH, Hsu CY, Chen JC. Injection therapy for stress incontinence in women [J]. Int Urogynecol J,1999 ； 10 (3) : 200-206.)。由于小分子的二醛（乙二醛、戊二醛）作为交联剂有一定的毒性，因此会 限制其应用。而葡聚糖是一种高度水溶性、生物相容性的大分子，葡聚糖的二醛衍生物就会 解决二酸小分子的毒性问题（Yaling Zhang，Lei Tao，Shuxi，Li，and Yen Wei，Synthesis of Multiresponsive and Dynamic Chitosan-Based Hydrogels for Controlled Release of Bioactive Molecules[J]. Biomacromolecules 2011，12,2894_2901.)。此外所选用的 蛋白质作为基元，除其本身具有好的生物相容性外，已报导的上千种不同功能的蛋白质也 将灵活的赋予所构建的水凝胶微球不同的功能。制备水凝胶微球的办法有很多，如微乳液 法、微流体法、溶剂蒸发法、凝聚法等，这些方法拥有各自的优缺点，其中微流体法虽然能得 到尺寸一致的微球，但是过程复杂、参数精细。而微乳液法虽然得到的微球尺寸不一致，具 有一定的分布，但是操作简单，只是将溶液混合便可得到微球。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶 微球的方法，该方法解决了水凝胶在使用过程中由于体积大而引起的形状无法达到理想要 求，以及在软组织填充方面的材料易引起生物体感染，填充表面形态不佳等缺点；并且蛋白 质水凝胶微球具有更好的生物相容性，制备成微球后在组织工程材料、药物缓释以及美容 等方面有广阔的应用前景。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球的方法，以牛血清白蛋 白为基体单元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球，具体通过以下步骤实现： 一、 称取〇. 5g~2g己二胺用水溶解配置成溶液25ml~50ml，用浓盐酸将溶液pH调整至 6~7. 5。随后将溶液缓慢滴加到100mg~300mg牛血清白蛋白（BSA)中，加入1-(3_二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)50mg~150mg后反应10h~12h，最终得到氨基化的BSA， BSA上面氨基修饰数目见表1。
[0005] 表1氨基化BSA上面连接_见12数目表格
二、 用30ml~50ml二甲基亚砜作为溶剂溶解1. 5g~2g葡聚糖、0. 5g~lg对羧基苯甲醛、 0. lg~0. 3g4-二甲氨基吡啶形成溶液，随后在溶液中加入1. 2g~l. 5g二环己基碳二亚胺后 反应开始，20~25°C反应18~24h，经后处理得到多官能团化的葡聚糖。
[0006] 三、将5 y 1~10 y 1助乳化剂、100~200mg/ml乳化剂10 y 1~15 y 1、步骤一得到 的氨基化的BSA 15 y 1~20 y 1、0. 05~0. 15M缓冲液PBS (磷酸缓冲盐溶液）pH=6. 5~8、 15 y 1~20 y 1、步骤二中得到的多官能团化的葡聚糖15 y 1~20 y 1加入到容器中，之后添加 350 y 1~400 y 1油相震荡60s~90s后便得到蛋白质水凝胶微球。
[0007] 本发明步骤二中，所述反应温度为20 °C或25 °C。
[0008] 本发明步骤二中，所述反应时间为20h或24h。
[0009] 本发明步骤二中，所述乳化剂是聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)。
[0010] 本发明步骤二中，所述助乳化剂是正丁醇。
[0011] 本发明步骤二中，所述油相是异辛醇。
[0012] 本发明步骤三中，所述乳化剂浓度是100mg/ml、150mg/ml或200mg/m。
[0013] 本发明步骤三中，缓冲液浓度为0. 05M、0. 1M或0. 15M。
[0014] 本发明步骤三中，缓冲液pH为6. 5、7或8。
[0015] 本发明具有以下有益效果： 1、本发明制备的蛋白质水凝胶微球具备生物相容性好、无毒害作用的优点，对生物体 的填充降低各种不良反应。
[0016] 2、本发明制备的蛋白质水凝胶微球水凝胶结构是共价键交联的稳定的三维网状 结构，具备一定的强度，并且填充生物体之后不会出现迀移等问题。
[0017] 3、本发明制备的蛋白质水凝胶微球可作为药物的载体，可载入具备消炎功能的药 物，将水凝胶填充入生物体组织后，可缓慢释放药物，消除因水凝胶的注入而引起的炎症。
[0018] 4、本发明制备的蛋白质水凝胶微球尺寸小，解决了大尺寸生物材料填充表面形态 不佳等缺点。
[0019] 5、合成步骤简单，操作方便，可以改变加工条件来改变微球尺寸，使得材料填充表 面形态进一步优化，是一种十分有效的制备蛋白质水凝胶微球的方法。
【附图说明】
[0020] 图1是实施例1制备的蛋白质水凝胶微球的粒径分布图； 图2是实施例1制备的蛋白质水凝胶微球显微镜照片； 图3是实施例2制备的蛋白质水凝胶微球的粒径分布图； 图4是实施例2制备的蛋白质水凝胶微球显微镜照片。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0022] 实施例1 : 在制备的过程中，称取lg己二胺配置成25ml水溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至6. 5。 随后将溶液缓慢滴加到200mg牛血清白蛋白（BSA)中，加入1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基 碳二亚胺盐酸盐（EDC) 100mg后搅拌反应10h，最终得到氨基化的BSA。然后用40ml二甲 基亚砜作为溶剂溶解2g葡聚糖、lg对羧基苯甲醛、4-二甲氨基吡啶形成溶液，随后在溶液 中加入1. 2g二环己基碳二亚胺后反应开始，20°C反应18h，经后处理得到多官能团化的葡 聚糖。将5yl助乳化剂、150mg/ml Triton X-100 (乳化剂）15yl、氨基化的BSA 15yl、 0. 05M缓冲液pH=7. 5 15 y 1、二官能团化的葡聚糖15 y 1加入到容器中，之后添加400 y 1 油相震荡30s后便得到蛋白质水凝胶微球，其粒径分布和显微镜照片如图1和2所示。
[0023] 实施例2: 在制备的过程中，称取lg己二胺配置成25ml水溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至6. 5。 随后将溶液缓慢滴加到200mg牛血清白蛋白（BSA)中，加入1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基 碳二亚胺盐酸盐（EDC) 100mg后搅拌反应10h，最终得到氨基化的BSA。然后用40ml二甲 基亚砜作为溶剂溶解2g葡聚糖、lg对羧基苯甲醛、4-二甲氨基吡啶形成溶液，随后在溶液 中加入1. 2g二环己基碳二亚胺后反应开始，20°C反应18h，经后处理得到多官能团化的葡 聚糖。将5yl助乳化剂、100mg/ml Triton X-100 (乳化剂）15yl、氨基化的BSA 15yl、 0. 05M缓冲液pH=7. 5 15 y 1、多官能团化的葡聚糖15 y 1加入到容器中，之后添加400 y 1 油相震荡30s后便得到蛋白质水凝胶微球，其粒径分布和显微镜照片如图3和4所示。此 时得到的微球尺寸较实施例1中的小，平均大小是22. 17 ym。
【主权项】
1. 一种以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球的方法，其特征在于 所述方法步骤如下： 一、 称取0. 5g~2g己二胺用水溶解配置成溶液25ml~50ml，用浓盐酸将溶液pH调整至 6~7. 5,随后将溶液缓慢滴加到100mg~300mg BSA中，加入EDC 50mg~150mg后反应10h~12h， 最终得到氨基化的BSA ; 二、 用30ml~50ml二甲基亚砜作为溶剂溶解I. 5g~2g葡聚糖、0. 5g~lg对羧基苯甲醛、 0. lg~0. 3g4-二甲氨基吡啶形成溶液，随后在溶液中加入I. 2g~l. 5g二环己基碳二亚胺后 反应开始，20~25°C反应18~24h，经后处理得到多官能团化的葡聚糖； 三、 将5 y 1~10 y 1助乳化剂、10 y 1~15 y 1乳化剂、15 y 1~20 y 1步骤一得到的氨基化 的BSA、15 y 1~20 y 1缓冲液、15 y 1~20 y 1步骤二中得到的多官能团化的葡聚糖加入到容 器中，之后添加350 y 1~400 y 1油相震荡60s~90s后便得到蛋白质水凝胶微球。2. 根据权利要求1所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球 的方法，其特征在于所述乳化剂的浓度为100~200mg/ml。3. 根据权利要求1或3所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微 球的方法，其特征在于所述乳化剂是聚乙二醇辛基苯基醚。4. 根据权利要求1所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球 的方法，其特征在于所述助乳化剂是正丁醇。5. 根据权利要求1所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球 的方法，其特征在于所述油相是异辛醇。6. 根据权利要求1所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球 的方法，其特征在于所述0. 05~0. 15M缓冲液的pH=6. 5~8。7. 根据权利要求1或6所述的以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微 球的方法，其特征在于所述缓冲液的浓度为0. 05~0. 15M。
【专利摘要】本发明公开了一种以牛血清白蛋白为基元反相微乳液制备蛋白质水凝胶微球的方法，其步骤为：一、称取己二胺配置成溶液，将溶液pH调整至6~7.5，随后将溶液缓慢滴加到BSA中，加入EDC后反应，最终得到氨基化的BSA；二、用二甲基亚砜作为溶剂溶解葡聚糖、对羧基苯甲醛、4-二甲氨基吡啶形成溶液，随后在溶液中加入二环己基碳二亚胺后反应开始，经后处理得到多官能团化的葡聚糖；三、将助乳化剂、乳化剂、氨基化的BSA、缓冲液、多官能团化的葡聚糖加入到容器中，之后添加油相震荡后便得到蛋白质水凝胶微球。本发明合成步骤简单，操作方便，可以改变加工条件来改变微球尺寸，使得材料填充表面形态进一步优化，是一种十分有效的制备蛋白质水凝胶微球的方法。
【IPC分类】A61L27/52, A61L27/22
【公开号】CN104940995
【申请号】CN201510365133
【发明人】黄鑫, 文苹, 刘小曼, 吴光瑜, 周佩
【申请人】哈尔滨工业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月29日