基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用
【技术领域】
[0001]本发明设计骨软骨缺损的修复，特别涉及一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
【背景技术】
[0002]骨软骨缺损是发生在骨性关节炎(Osteoarthritis，0A)晚期的一个重要病理变化，骨性关节炎是最常见的骨科疾病并导致巨大医疗消耗，因此世界卫生组织启动第二个“骨关节十年”计划对抗0A，由于关节软骨缺乏自我修复能力，所以关节软骨缺损修复是临床治疗骨关节炎的最大挑战。到目前为止，临床上对于骨软骨缺损的治疗以自体软骨细胞移植为首选，尽管其疗效确切，但它的手术适应症有限，80%的病人最终选择了关节置换手术，但其手术风险大和术后易出现并发症和合并症，且长期疗效不佳的特点。因此，寻找治疗骨软骨缺损的有效治疗方法是当务之急。
[0003]虽然通过细胞移植来治疗骨关节炎已经被广泛研宄，通过自体细胞归巢而不经过细胞的移植，作为一种有前景的方法目前仍然缺乏研宄。一般认为骨软骨缺损可以通过缺损底部的骨髓间充质干细胞(BMSC)来修复，然而最近的研宄也表明部分修复的软骨来自缺损周边软骨细胞的浸润。因此设计一种能够促进自体细胞迀移的材料非常重要。由于材料的三维结构和孔隙率等性质都可以影响细胞在其内部的生长，目前大多数的材料结构都是无序的并不利于细胞的迀移，因此设计一种放射状的材料具有重要的意义。基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)在很多器官中表达，研宄表明它能够促进干细胞的归巢和迀移。因此我们探讨了通过放射状胶原支架结合SDF-1对促进细胞迀移和软骨再生的作用。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术的不足，提出了一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用。
[0005]本发明提供一种基质细胞衍生因子的新用途，即基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，本发明以放射状胶原支架结合SDF-1为个例，对材料的物理表征以及材料在体外对骨髓间充质干细胞的迀移进行了研宄，明确了放射状胶原支架结合SDF-1对兔子股骨骨软骨缺损的修复作用。现有的生物材料用于骨软骨缺损时无法促进间充质干细胞的迀移，往往无法达到较好的修复效果，本发明在使用了放射状胶原支架的基础上，还结合了能够促进干细胞迀移的SDF-1来修复骨软骨缺损。
[0006]本发明采用的技术方案是:
步骤一:采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架
将内径为5.0mm,高为20.0mm的圆柱形模具，在_20°C下冷冻作为冷冻源，在模具的中央设有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料；将胶原水溶液加入模具中，在-20 V的温度下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶成放射状；当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将模具在_80°C放置至胶原结晶温度降至-80°C，将模具真空干燥48~120小时，获得放射状胶原支架；
步骤二:所述胶原水溶液的制备
剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a中，4°C过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L乙酸水溶液中，调节pH值为I后加入胃蛋白酶，4°C放置3天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4°C过夜，离心，取下层胶原混合物b加入1/4体积的0.5mol/L乙酸水溶液在4°C溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80°C冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL的胶原水溶液，4°C保存；所述混合溶液a中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L,乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L,氯化钠终浓度为0.5mol/L ;所述胃蛋白酶的用量为10mg酶/Ig预处理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg
步骤三:结合SDF-1的放射状胶原支架的制备
以1:2.5的比例将100ng/ml的SDF-1溶于浓度为40mg/ml的纤维凝胶缓冲A液中，再与40mg/ml的纤维凝胶B液1:1混合，获得混合液；将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架。
[0007]基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
[0008]本发明有益效果主要体现在:本发明提供一种能够促进自体细胞迀移的含SDF-1的放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，其通过两个方面促进了干细胞的迀移，现有的材料多数结构紊乱，而骨软骨缺损是需要能够促进间充质干细胞迀移的材料；本发明明确了含SDF-1的放射状胶原支架制作方法，并实现了体内的功能检验，为含SDF-1的放射状胶原支架的临床应用供了基础。
【附图说明】
[0009]图1为制备放射状胶原支架示意图；
图2A为制备的放射状胶原支架垂直面扫描图；
图2B为制备的放射状胶原支架水平面电镜扫描图；
图3A为制备的传统胶原支架垂直面扫描图；
图3B为制备的传统胶原支架水平面电镜扫描图；
图4为体外骨髓间充质干细胞迀移模型；
图5A为传统胶原支架；
图5B放射状胶原支架；
图5C为结合SDF-1的放射状胶原支架苏木精伊红染色图；
图6A为传统胶原支架荧光DAPI染色图；
图6B放射状胶原支架荧光DAPI染色图；
图6C结合SDF-1的放射状胶原支架荧光DAPI染色图；
图7a为实施例2中传统胶原支架组大体动物标本照片；
图7b为放射状胶原支架组大体动物标本照片； 图7c为结合SDF-1和放射状胶原支架组大体动物标本照片；
图8为实施例2中大体动物标本照片，a为传统胶原支架组，b为放射状胶原支架组，c为结合SDF-1和放射状胶原支架组的ICRS评分；
图9a为实施例2中传统胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图9b为实施例2中放射状胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图9c为实施例2中结合SDF-1和放射状胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图10 a为传统胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图；
图10 b为放射状胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图；
图10 c为结合SDF-1和放射状胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图图11 a为传统胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图；
图11 b为放射状胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图；
图11 c为结合SDF-1和放射状胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明实施例所用实验材料:
实验动物:雌性新西兰大白兔(2.5kg) SPF由浙江大学动物实验中心提供。
[0011]实验药品:
纤维凝胶杭州普济公司其他试剂:美国Sigma公司实验仪器设备:
搅拌机金坛市国旺实验仪器厂
石蜡切片机德国MICROW公司
显微镜摄影机日本OLYMPUS公司
BMJ-1II包埋机及冷冻台中国常州中威电子仪器有限公司
扫描电镜日立
实施例1支架制备及检测:
(I)制备放射状胶原支架:采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架，所述放射状胶原支架装置为一内径为5.0mm，高20.0mm的模具，该模具为圆柱形，并在-20°C下冷冻作为冷冻源。在模具的中央有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料。将胶原水溶液加入模具中，继续在-20°C下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶。当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将放射状胶原支架装置在-80°C放置至放射状胶原支架温度降至_80°C，将放射状胶原支架装置真空干燥48小时，获得胶原支架。制备支架过程的示意图见图1。倍数扫描电镜图显示，