有序胶原支架结构稳定、规则，在水平方向呈放射状，在垂直方向上平行排列，见图2A和图2B。
[0012](2)制备传统胶原支架:传统胶原支架制备装置同上，在胶原水溶液结晶时置于液氮下快速结晶，后经冻干即可获得，倍数扫描电镜图见图3A和图3B所示，胶原支架结构杂乱无序。
[0013](3)制备结合SDF-1的放射状胶原支架:以1:2.5的比例将SDF-1 (100ng/ml)溶于纤维凝胶缓冲A液中(40mg/ml)，再与纤维凝胶B液1:1混合。将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架(图5A、图 5B、图 5C)。
[0014](4)体外骨髓间充质干细胞迀移模型检测:骨髓间充质干细胞以2*105/孔的数量种植在非黏附24孔板上，加入传统胶原支架，放射状胶原支架，结合SDF-1的放射状胶原支架培养，示意图见图4。24小时后，用PBS冲洗支架5次然后进行组织学染色。从DAPI来看，放射状胶原支架上细胞数量多于传统支架，SDF-1的加入进一步增强了这种效果(图6A、图 6B、图 6C)。
[0015]实施例2
基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用 1、动物模型建立和支架植入
①麻醉:按40mg/kg计算，用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉。
[0016]②在无菌环境下行兔子膝关节皮肤准备:用2%碘伏消毒，沿髌韧带内侧缘切开约Icm大小的切口，逐层切开暴露膝关节，用带刻度的手摇转在股骨滑车钻取4_直径和5mm深度的骨软骨缺损，完成造模。
[0017]2、动物实验分组:
18只新西兰大白兔全部进行造模，制造缺损后随机分为3组:传统胶原支架组，放射状胶原支架组和含SDF-1放射状胶原支架组，各6只。
[0018]3、标本采取:
将步骤I中造模兔子分成三组，即传统胶原支架组，放射状胶原支架组和含SDF-1放射状胶原支架组，将三种胶原支架(实施例1制备)植入潮线以下位置，即支架的上表面与潮线在一条直线上，立即消毒，缝合。
[0019]实验后12周处死所有兔子，取兔子膝关节股骨，置于10%福尔马林中浸泡固定48h后，进行大体观察、ICRS评分，接着经质量浓度4%乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液脱钙8周，经脱水，石蜡包埋切片，按常规番红-阿辛蓝(SO)染色，进行病理组织学分析。
[0020]4、指标测定方法:
(I)国际软骨修复协会软骨损伤分级系统(ICRS):缺损修复程度:完全修复为4分，75%修复为3分，50%修复为2分，25%修复为I分，0%修复为O分；与周围正常软骨的结合程度:与正常软骨组织完全融合为4分，与边界的距离小于Imm为3分，3/4与周围组织相连但1/4的组织大于1_厚度为2分，1/2组织与周围组织相连但1/2的组织大于Imm厚度为I分，未和周围组织相连为O分；大体观察:完整的表面组织为4分，纤维化的表面为3分，小的且分散的组织委2分，大的缺损为I分，无任何组织为O分。整体评分:一级为12分；二级为11-8分；三级为7-4分；四级为3-1分。
[0021](2)组织学检测:组织切片经过脱蜡，水化后用0.02% Fastgreen染8min，然后自来水洗去多余的染料，1%醋酸中分色，水洗，0.1% Safrain-O染2min，脱色，透明，封片用于观察。同时行I型胶原和MMP13免疫组化检测。
[0022]5、统计学方法
统计学处理:计量数据均用x±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行处理。多组间比较及两两之间比较采用方差分析。p〈0.0l认为两两组之间有显著统计学差异，P〈0.05认为两两组之间有统计学差异。
[0023]6、实验结果
6.1缺损部位的大体观察，ICRS评分及SO染色
从大体上看，放射状胶原支架结合SDF-1的软骨修复表面更加平滑(图7a、图7b、图7c)，进行国际软骨修复协会ICRS评分后，12周后，有序支架修复效果显著高于无序，同时SDF-1对修复有一定的促进作用(图8A、图SB、图SC)。从组织学切片上可以发现，传统胶原支架组表面粗糙，新生的组织主要是纤维组织，而放射状胶原支架组和含SDF-1的放射支架修复之后，新生的组织为一层厚的透明软骨组织(图9a、图％、图9c)。因此可以认为放射状胶原支架对软骨的再生过程具有促进作用，同时SDF-1对这个过程有一定的促进作用。
[0024]6.2放射状胶原支架结合SDF-1减少体内软骨骨化及软骨降解
除了软骨修复，我们还对骨化程度和软骨降解进行了评估，Coll (软骨骨化标志物)在传统支架组中表达远高于放射状支架组、含SDF-1的放射状支架组，同时SDF-1的添加一定程度上也减少了 Coll的表达(图10a、图10b、图10c)，这表明含SDF-1的放射状支架可以有效的抑制损伤部位的骨化。同样的，MMP13 (软骨降解标志物)在传统支架组中表达远高于放射状支架组、含SDF-1的放射状支架组，同时SDF-1的添加一定程度上也减少了 MMP13的表达(图11a、图11b、图11c)。这表明含SDF-1的放射状支架可以有效的抑制损伤部位的软骨的降解。
【主权项】
1.基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: 步骤一:采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架 将内径为5.0mm,高为20.0mm的圆柱形模具，在_20°C下冷冻作为冷冻源，在模具的中央设有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料；将胶原水溶液加入模具中，在-20°C的温度下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶成放射状；当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将模具在_80°C放置至胶原结晶温度降至-80°C，将模具真空干燥48~120小时，获得放射状胶原支架； 步骤二:所述胶原水溶液的制备 剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a中，4°C过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L乙酸水溶液中，调节pH值为I后加入胃蛋白酶，4°C放置3天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4°C过夜，离心，取下层胶原混合物b加入1/4体积的0.5mol/L乙酸水溶液在4°C溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80°C冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL的胶原水溶液，4°C保存；所述混合溶液a中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L,乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L,氯化钠终浓度为0.5mol/L ;所述胃蛋白酶的用量为10mg酶/Ig预处理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg 步骤三:结合SDF-1的放射状胶原支架的制备 以1:2.5的比例将100ng/ml的SDF-1溶于浓度为40mg/ml的纤维凝胶缓冲A液中，再与40mg/ml的纤维凝胶B液1:1混合，获得混合液；将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架。2.根据权利要求1所述的基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用，该方法包括采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架，胶原水溶液的制备和结合SDF-1的放射状胶原支架的制备，本发明提供一种能够促进自体细胞迁移的含SDF-1的放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，其通过两个方面促进了干细胞的迁移，现有的材料多数结构紊乱，而骨软骨缺损是需要能够促进间充质干细胞迁移的材料；本发明明确了含SDF-1的放射状胶原支架制作方法，并实现了体内的功能检验，为含SDF-1的放射状胶原支架的临床应用供了基础。
【IPC分类】A61L27/50, A61L27/54, A61L27/24
【公开号】CN104940996
【申请号】CN201510304764
【发明人】陈鹏飞, 欧阳宏伟, 陶佳栋
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月4日