作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的 确认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。将HMGB1 的片段（氨基酸序列：第11~44个氨基酸、合成肽，由MBL制造）100 y g稀释到Dulbecco 的PBS (D-PBS) 200 y L中，制备试验药。阴性对照使用D-PBS 200 y L。手术第二天从尾静脉 进行初次施用，之后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价，在术后的第1、3、7、10、 14、17、21日进行BMS(后肢运动功能评分，Basso Mouse Scale)评分。
[0112] (结果）
[0113] BMS评分中，与PBS施用组相比，施用了 HMGB1片段的组中从手术后第3日可观察 到显著性的神经症状的改善。特别是术后第3日、第7日、第14日、第17日的症状改善显 著（图2A)。另外，在损伤部位的脊髄的HE染色像中，阴性对照组可见宽范围的损伤（D1)， 而HMGB1片段（11~44肽）施用组可见损伤部分（D2)缩小、病理组织上也可见治疗效果 (图 2B)。
[0114] (考察）
[0115] 通过施用HMGB1片段，可见脊髄受到损伤的小鼠的神经症状明显改善。本试验中 使用的HMGB1片段可见骨髄间充质干细胞的动员活性，可期待被动员的骨髄间充质干细胞 产生脊髄损伤的治疗效果。作为针对骨髄间充质干细胞的组织损伤的作用，除了因多能性 而向神经分化引起的组织再生以外，还可期待骨髄间充质干细胞所分泌的生长因子、细胞 因子等引起的损伤组织的保护作用。本次试验中推测，到术后第1周至的短期效果为后者 的作用，之后前者的作用再发挥影响。
[0116] 实施例3
[0117] (方法）
[0118] 受验动物使用小鼠C57BL6/J、7周龄雌性小鼠。用异氟醚进行吸入麻醉，切开背部 正中线的皮肤使第9胸椎的椎弓露出并切除。使该部位的硬膜露出，用微型持针器从硬膜 上将脊髄夹住3秒钟，制作外伤性脊髄损伤。在制作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的确 认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。HMGB1的片 段通过将（氨基酸序列：第11~44个氨基酸、合成肽，由MBL制造）100 y g稀释到Dulbecco 的PBS(D-PBS)200 y L中来制备。HMGB1的全长蛋白如已报告的通过将使HEK293表达、制 造并精制的HMGB1 (100 yg)稀释到D-PBS200 y L中来制备。阴性对照使用D-PBS 200 y L。 手术第二天从尾静脉进行初次施用，之后后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价， 在术后的第1、3、7、14日进行BMS评分。
[0119] (结果）
[0120] 用BMS评分评价神经症状的改善效果。在第7、14日的任一时刻，HMGB1片段（第 11~44个氨基酸）施用组中均可见最有效的治疗效果。HMGB1 (全长）施用组虽与阴性对 照组相比可见治疗效果，但却未见如HMGB1片段（第11~44个氨基酸）那样的治疗效果 (图 3)。
[0121] (考察）
[0122] 在制作脊髄损伤后，在早期、HMGB1全长施用组可见介于HMGB1片段（第11~44 个氨基酸）施用组与阴性对照组中间的程度的治疗效果，但在脊髄损伤制作后第14日，在 HMGB1片段（第11~44个氨基酸）施用组可见与其他组相比极其良好的改善。通过本次 实验清楚了，在治疗效果方面具有针对脊髄损伤的超出全长蛋白的有效性。由于如本片段 这样可化学合成的肽在药物制造中能够大量制造廉价且均匀的制品，因此考虑在实用化方 面的有用性极高。
[0123] 实施例4
[0124] (方法）
[0125] 受验动物使用小鼠C57BL6/J、7周龄雌性小鼠。用异氟醚进行吸入麻醉，切开背部 正中线的皮肤使第9胸椎的椎弓露出并切除。使该部位的硬膜露出，用微型持针器从硬膜 上将脊髄夹住3秒钟，制作外伤性脊髄损伤。在制作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的 确认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。HMGB1的 片段通过将（氨基酸序列：第11~44个氨基酸和第1~44个氨基酸、合成肽，由MBL制 造）100 y g稀释到D-PBS 200 y L中制备。阴性对照使用D-PBS 200 y L。手术第二天从尾 静脉进行初次施用，之后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价，在术后的第1、3、7、 10、14、17、21、28 日进行 BMS 评分。
[0126] (结果）
[0127] 用BMS评分评价神经症状的改善效果。在17、21、28日的任一时刻，与阴性对照组 相比在HMGB1片段（第11~44个氨基酸和第1~44个氨基酸）施用组均可见治疗效果。 由第11~44个氨基酸构成的HMGB1片段和由第1~44个氨基酸构成的HMGB1片段的治 疗效果基本为同程度（图4)。
[0128] (考察）
[0129] HMGB1片段11~44、1~44均可见在脊髄损伤的治疗效果方面的有效性。如图1 所示，发明者们清楚了，HMGB1的骨髄间充质干细胞动员活性的核心区域之一为由第17个 氨基酸至第25个氨基酸构成的肽。11~44的片段、1~44的片段均包含17~25,推测 这些肽显示药效的核心肽为17~25的序列。据报告HMGB1全长蛋白动员骨髄间充质干细 胞时并不介由RAGE (2011年PNAS玉井等），并且也没有11~44的片段、1~44的片段为 RAGE等已知受体的配体的报告，由此推测这些片段以迄今为止尚未知道的受体为靶。
[0130] 产业上的可利用性
[0131] 通过本发明，提供用于治疗脊髄损伤的维持了 TOGFRa阳性细胞的动员活性的 HMGB1片段肽的新用途。本发明的HMGB1片段肽相对于全长由215个氨基酸构成的HMGB1 蛋白，分子量为约20%以下。这样的片段肽能够通过使用了肽合成机的化学合成来生产，因 此在将肽制造为药物的情况下，可期待提高精制纯度、稳定生产、削减成本。
[0132] 另外已知，全长的HMGB1具有与作为内毒素之一的LPS(脂多糖）结合的活性，当 药品中即使少量混入LPS时，也会引起发热等，并常常与严重的副作用相关联，因此严格限 制LPS在药品中的混入。HMGB1由于与LPS具有亲和性，因此难以将药品中混入的LPS完全 除去。但是通过肽化会与LPS的亲和性降低，因此预计药品中LPS的混入也减少。因此，通 过使用本发明中确定的包含TOGFRa阳性细胞动员部分的HMGB1片段，能够开发出更安全 的脊髓损伤治疗用药物组合物。
[0133] 通过将本发明的HMGB1片段直接施用到需要再生的脊髓损伤部位或其附近部位， 能够诱导或促进该损伤的再生。此外，在静脉内施用等的方法中，通过将本发明的HMGB1片 段施用到与需要再生的部位不同的部位，还能够诱导或促进脊髓损伤的再生。如此，本发明 中，能够通过在一般诊疗中广泛施行的静脉施用进行脊髓损伤的治疗，因此能够将治疗剂 以任意的次数、任意的浓度安全且简便地进行施用。与以往的治疗方法相比，该情况是本申 请发明极其优异的方面之一。
[0134] 另外，在目前的再生医疗或细胞治疗的现场，在生物体外培养患者来源的稀少的 骨髄多能干细胞、在使其增殖后用于治疗，但该培养过程有伴随着细胞劣化（癌化或细菌、 病毒等的污染）的危险，因此需要充分的安全管理。与此相对，基于本发明的治疗剂由于不 包含将细胞取出到体外的工序、或增加人工操作的工序，因此认为安全性较高。与以往的治 疗方法相比，该情况也是本申请发明优异的方面之一。
【主权项】
1. 一种用于治疗脊髄损伤的药物组合物，其含有HMGBl片段肽。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽为包含选自序列号3、 序列号4和序列号5中的氨基酸序列的肽。3. 权利要求1所述的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽为由选自序列号3、序列号 4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。
【专利摘要】本发明合成了由HMGB1蛋白的一部分构成的具有适当长度的片段肽，并确认了该肽显示脊髄损伤的治疗效果。
【IPC分类】A61P25/00, A61K38/16, C07K14/52
【公开号】CN104955470
【申请号】CN201380067951
【发明人】玉井克人, 山崎尊彦, 崔文浩
【申请人】吉诺米克斯股份有限公司, 国立大学法人大阪大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年10月24日
【公告号】CA2889299A1, EP2913059A1, US20150274792, WO2014065348A1