用于生长激素递送的脂肪酸酰化的氨基酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明的技术领域涉及用于口服递送治疗性生长激素化合物的脂肪酸酰化的氨 基酸（FA-aa)和包含此类FA-aa的药物组合物。
[0002] 背景 许多由某些大分子（例如蛋白和肽）的产生的缺陷或完全失效引起的病理学状态用治 疗性大分子（诸如亲水肽或蛋白）的侵袭性且不方便的胃肠外施用来治疗。其一个实例是 通常通过每日一次剂量的hGH施用人生长激素（hGH)用于治疗生长激素缺陷或其中患者得 益于循环生长激素的量增加的疾病或病症。相比于此，由于它的非侵袭性性质对于口服施 用药物而言是期望的，且具有减少患者的与药物施用相关的不适和增加药物依从性的巨大 潜力。然而，存在几个障碍；诸如在胃肠（GI)道中的酶促降解，药物流出泵，从肠粘膜的吸 收的不足和变化，以及在肝脏中的首过代谢，并且迄今为止尚未发现用于口服递送治疗性 亲水蛋白的广品面市。
[0003] 生长激素（GH)是一种由哺乳动物垂体前叶分泌的多肽激素。根据物种，GH是一 种由约190个氨基酸残基组成的蛋白，相当于约22 kDa的分子量。GH与细胞表面受体GH 受体（GHR)结合，并通过GH受体信号传导。GH在促进生长、保持正常身体组成、合成代谢 和脂质代谢中发挥关键作用。它还对中间代谢具有直接作用，诸如葡萄糖摄取降低、脂解作 用增加以及氨基酸摄取和蛋白合成的增加。该激素还对其它组织发挥作用，包括脂肪组织、 肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。重组hGH已经生产且可商业获得，例如 ：Gen〇tr〇pin? (Pharmacia Upjohn)、Nutropin? 和Protropin? (Genentech)、Humatrope? (Eli Lilly)、 Serostim ? (Serono)、诺地托品(Norditropin) (Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、 Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外，在N末端具有额外甲硫氨酸残基的变体 还作为例如 Somatonorm? (Pharmacia Upjohn/Pfizer)销售。
[0004] 人生长激素被存在于胃中（胃蛋白酶）、肠腔中（糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性酶、羧 肽酶等）和胃肠道粘膜表面中（氨肽酶、羧肽酶、肠肽酶、二肽基肽酶、内肽酶等）的多种消 化酶降解。
[0005] 已经探索用于获得蛋白酶稳定化的人生长激素化合物的各种途径，并且此类分子 的实例描述于W0 2011/089250和W02011/089255。随后用于获得口服治疗剂的挑战是口服 施用的化合物的增加的生物利用率。
[0006] 其次，口服施用的蛋白化合物必须在其进程过程中通过胃肠道吸收。空肠与十二 指肠和回肠连接，并且专门吸收消化产物，诸如糖、氨基酸和脂肪酸，这得到粘膜的大表面 积的帮助。
[0007] 空肠和回肠内衬的上皮细胞实现了营养素的被动转运和氨基酸、小肽、维生素和 葡萄糖的主动转运。上皮细胞对肽和特别大的蛋白分子的摄取因此对于生成口服药物组合 物非常关键。
[0008] 正在探索多种技术，且本发明涉及脂肪酸酰化的氨基酸的用途，所述脂肪酸酰化 的氨基酸是来自化妆品的先前已知成分，且主要用于增加经皮吸收。
[0009] F5ger等人描述了分子量对亲水肽药物的口服吸收的影响，并显示，渗透性随着此 类亲水肽药物的分子量增加而降低（Amino Acids(2008) 25: 233-241，D0I10. 1007/S00726-007-0581-5)。
[0010] 对具有低刺激作用的新表面活性剂的研宄，已经导致了源自氨基酸的不同表面活 性剂的开发（Mitjans 等人，2003; Benavides 等人，2004; Sdnchez 等人，ZOC^oFA-aa 是基于氨基酸的表面活性剂，并且因此是具有低毒性的、温和的可生物降解的表面活性剂。
[0011] US2004147578 (W0 0207506)涉及脂肪酸酰化的氨基酸，其被用作疏水分子包括 疏水大分子（诸如环孢菌素）的渗透增强剂。
[0012] W02001035998涉及酰化的氨基酸，其被用作大分子（诸如亲水肽或蛋白）的经皮 和经粘膜吸收促进剂。
[0013] W02004064758涉及一种口服组合物，其用于递送药用肽，诸如胰岛素、生长激素和 GLP-1，其中活性肽在不是天然酰胺化的位点被酰胺化。所述组合物可以包含吸收增强剂， 例如酰基肉毒碱，其使用PTH1-34的制剂中的月桂酰肉毒碱例举。
[0014] US2005282756涉及一种干粉组合物，其包含胰岛素和吸收增强剂。
[0015] W02003030865涉及胰岛素组合物，其包含表面活性剂诸如离子型表面活性剂，并 且还含有油或脂质化合物诸如甘油三酯，且进一步包含长链酯化的脂肪酸。
[0016] W02004064758涉及一种用于递送药用肽的口服药物组合物，其包含吸收增强剂 (诸如酰基肉毒碱、磷脂和胆汁酸）。
[0017] US2006093632涉及可注射组合物，当注入水中时，其形成沉淀，导致产生持续释放 制剂。
[0018] EP0552405公开了用于化合物诸如吲哚美辛和邻氨基苯甲酸衍生物的经皮吸收促 进剂。
[0019] 口服施用途径对于高分子量化合物诸如生长激素是非常复杂的，并且需要进一步 改进以建立适合于治疗患者的可接受的组合物，其具有生长激素化合物的有效的生物利用 率。
[0020] 概述 已经令人惊讶地发现，脂肪酸氨基酸（FA-aa)例如N-酰化的氨基酸增加口服施用后的 生长激素化合物的吸收。
[0021] 由于它们的低毒性和增加治疗性大分子（诸如亲水肽或蛋白）的口服生物利用率 的作用，根据本发明的FA-aa是口服药物组合物中的有价值的成分。根据本发明的FA-aa 在包含生长激素化合物的口服药物组合物中是特别有价值的。这对于需要长期施用治疗性 大分子（例如生长激素）的疾病（但不限于此）而言是重要的，因为最非侵袭性的、无毒的 药物施用在任何治疗中通常是有利的，对于治疗剂的偶尔施用或大批施用也是如此。
[0022] 到目前为止，没有任何生长激素化合物可用作口服制剂，这主要是由于此类化合 物的酶促降解和非常低的肠渗透性的巨大挑战。
[0023] 本发明的一个方面是药物组合物，其包含在其a -氨基被8至18个碳的脂肪酸酰 化的某些氨基酸和活性成分，诸如生长激素化合物。药物组合物的组成使得其适合于口服 施用，因为观察到增加的生物利用率。
[0024] 本发明涉及适合用于口服施用生长激素化合物的药物组合物，其包含充当渗透增 强剂的FA-aa。
[0025] 本发明还可以解决其它问题，这从示例性实施方案的公开内容来看是显而易见 的。本发明涉及包含FA-aa的药物组合物，所述FA-aa适合用于增加生长激素化合物的吸 收和/或生物利用率，这对于待口服施用的药物组合物特别重要。
[0026] 如从本文公开内容将显而易见的是，目标化合物被描述为（脂肪酸）酰化的氨基 酸或脂肪酸N-酰化的氨基酸，或简单地，简称FA-aa，其描述具有氨基酸基本结构的化合 物，其中a氨基通过形成肽样键被脂肪酸酰化。
[0027] 本发明的一个方面涉及包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物 组合物。本文所述的FA-aa包括脂肪酸部分和作为核心结构的氨基酸骨架。已经发现该 化合物增加当施用于肠时生长激素化合物的生物利用率。在进一步方面，所述组合物包含 FA-aa，其中脂肪酸部分具有12、14或16个碳原子。
[0028] 生长激素化合物相比于人生长激素增加的稳定性对于获得可以口服和/或以足 够间隔施用的制剂是有利的。在进一步的方面，组合物包含T/ 2高于30分钟的生长激素化 合物。
[0029] 在进一步方面，本发明涉及用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法，其包 括在生长激素化合物的药物组合物中包括FA-aa的步骤。本发明的其他方法旨在增加生长 激素化合物的血浆浓度，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于包含生长激素化合物和 FA-aa的药物组合物，由此在所述个体中观察到所述生长激素化合物的血浆浓度增加。其还 涉及到考虑，在组合物中包括FA-aa使得施用的生长激素化合物的生物利用率或血浆浓度 的增加大于当不包括至少一种FA-aa的情况下施用该化合物观察到的增加。
[0030] 本发明的一个方面涉及用于治疗生长激素相关的疾病或病症的方法，其包括施用 包含生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物。
[0031] 附图简要说明 图1.类似于实施例8和11中描述的程序使用有（实心标记）和没有（空心标记） C16-G1U的制剂肠内施用后随着时间的生长激素类似物GH-A2的平均血浆浓度。
[0032] 图2.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A1的药代动力学概况测定的平均AUC。 所比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研宄： 无增强剂（69次研宄，其中n=6)，C~12-肌氨酸盐（2次研宄，其中n=6)，和C16-肌氨酸盐 (14次研宄，其中n=6)。
[0033] 图3.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A2的药代动力学概况测定的平均AUC。所 比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研宄：无 增强剂（12次研宄，其中n从6-12变化），C10-Gly (1次研宄，n=12)，C12-His (1次研宄， n=12)，C12-Pro (1次研宄中，n=12)，C16-肌氨酸盐（5次研宄，n从6-12变化）和C16-G1U (1次研宄，n=12)。
[0034] 图4.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A3的药代动力学概况测定的平均AUC。 所比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研宄： 无增强剂（2次研宄，其中n=6)，C8-His (2次研宄，其中n=6)，C8-肌氨酸盐（2次研宄， 其中 n=6)，ClO-Asp (2 次研宄，其中 n=6)，C10-Gln (2 次研宄，其中 n=6)，C12-Trp (2 次研宄，其中n=6)，C12-肌氨酸盐（2次研宄，其中n=6)，C12-Pro (2次研宄，其中n=6)， C16-肌氨酸盐（7次研宄，其中n=6)，C16-Glu (2次研宄，其中n=6)和C18=肌氨酸盐（2 次研宄，其中n=6)。
[0035] 图5.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A1的药代动力学概况测定的平均AUC。 缓冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐（30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶 抑制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研宄：无增强剂（69次研宄，其 中n=6)，C16-肌氨酸盐（14次研宄，其中n=6)，SBTI (1次研宄，n=6)和C16-肌氨酸盐+ SBTI (1 次研宄，n=6)。
[0036] 图6.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A2的药代动力学概况测定的平均AUC。缓 冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐（30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶抑 制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研宄：无抑制剂（12次研宄，其中 n从6-12变化），C16-肌氨酸盐（5次研宄，其中n从6-12变化），SBTI (3次研宄，其中n 从6-9变化）和C16-肌氨酸盐+ SBTI (5次研宄，其中n从6-9变化）。
[0037] 图7.从含水缓冲液中配制的化合物GH-A3的药代动力学概况测定的平均AUC。 缓冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐（30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶 抑制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研宄：无抑制剂（2次研宄，其 中n=6)，C16-肌氨酸盐（7次研宄，其中n=6)，SBTI (1次研宄，n=6)，和C16-肌氨酸盐+ SBTI (1 次研宄，n=6)。
[0038] 详述 所选定义 如本文所使用的术语"多肽"和"肽"是指通过肽键连接的至少两个氨基酸构成的化合 物。
[0039] 术语"氨基酸"包括遗传密码编码的氨基酸（其在本文中被称为标准氨基酸）的 组。还包括的是并非由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。通常已知的天然氨基 酸包括Y_羧基谷氨酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、肌氨酸和磷酸丝氨酸。通常已知的合成氨基酸 包括通过化学合成制备的氨基酸，诸如Aib (a-氨基异丁酸）、Abu (a-氨基丁酸）、He (叔丁基甘氨酸）、0 _丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
[0040] 如本文所使用的术语"蛋白"是指由一个或多个多肽组成的生化化合物。
[0041] 当本文中使用时，术语"药物"、"治疗剂"、"药剂"或"药品"是指药物组合物中使 用的活性成分，其可以在治疗中使用。
[0042] 自然界中已经描述了至少300种氨基酸，但这些中只有二十种通常作为人肽和蛋 白中的组分存在。
[0043] 细胞在肽生物合成中使用20种标准氨基酸，并且这些由一般遗传密码指定。所述 二十种标准氨基酸是丙氨酸（Ala)、缬氨酸（Val)、亮氨酸（Leu)、异亮氨酸（lie)、苯丙氨酸 (Phe)、色氨酸（Trp)、甲硫氨酸（Met)、脯氨酸（Pro)、天冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)、甘氨酸 (Gly)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)、半胱氨酸（Cys)、酪氨酸（Tyr)、天冬酰胺（Asn)、谷氨酰 胺（Gin)、赖氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)和组氨酸（His)。肌氨酸与甘氨酸的差异在于用_ CH 3交换-H，且对于以下也被认为是氨基酸。
[0044]标准氨基酸可以分成极性氨基酸和非极性氨基酸。极性氨基酸是天冬氨酸（Asp)、 谷氨酸（Glu)、赖氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)、组氨酸（His)、谷氨酰胺（Gln)、天冬酰胺 (Asn)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)和半胱氨酸（Cys)，且非极性氨基酸是甘氨酸（Gly)、丙 氨酸（Ala)、亮氨酸（Leu)、缬氨酸（Val)、异亮氨酸（lie)、甲硫氨酸（Met)、脯氨酸（Pro)、 酪氨酸（Tyr)、色氨酸（Trp)和苯丙氨酸（Phe)。
[0045] 极性氨基酸可以被细分为不带电的极性氨基酸（谷氨酰胺（Gln)、天冬酰胺 (Asn)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)和半胱氨酸（Cys))和带电的极性氨基酸（天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸（Glu)、赖氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)和组氨酸（His))。
[0046] 非极性氨基酸可以根据疏水性区分，使得非极性且疏水中性氨基酸是甘氨酸和丙 氨酸，和非极性且疏水性氨基酸是亮氨酸（Leu)、缬氨酸（Val)、异亮氨酸（lie)、甲硫氨酸 (Met)、脯氨酸（Pro)、酪氨酸（Tyr)、色氨酸（Trp)和苯丙氨酸（Phe)。
[0047]后一组可以基于侧链是脂族（亮氨酸（Leu)、缬氨酸（Val)、异亮氨酸（lie)、甲硫 氨酸（Met)和脯氨酸（Pro))或芳族（酪氨酸（Tyr)、色氨酸（Trp)、苯丙氨酸（Phe))区分。 [0048] 脂肪酸是具有长脂族尾（链）的羧酸。
[0049] 术语"脂肪酸氨基酸"、"脂肪酸N-酰化的氨基酸"或"酰化的氨基酸"或"脂肪酸 酰化的氨基酸"可互换使用，并且当本文中使用时是指在其a -氨基被脂肪酸酰化的氨基 酸。该分子简称为"FA-aa"。
[0050] 术语"口服生物利用率"在本文中是指，施用的药物剂量的部分，所述部分在已经 口服施用之后到达全身循环。通过定义，当静脉内施用药物时，其生物利用率是100%。然 而，当口服施用药物时，活性成分的生物利用率由于降解、不完全吸收和首过代谢而下降。
[0051] 术语"生物活性"应当表示生长激素化合物在相关参考系统中的活性，并且可以在 本领域技术人员已知的各种测定，例如，诸如实施例1中所述的BAF测定中进行测量。
[0052] 如本文所使用的术语"表面活性剂"是指可以吸附在表面和界面（诸如但不限于 液体-空气、液体-液体、液体-容器或液体-任何固体）处的任何物质，尤其是去污剂。
[0053] 如本文所使用的术语"非离子型表面活性剂"是指可以吸附在表面和界面（如液 体-空气、液体-液体、液体-容器或液体-任何固体）处的任何物质，尤其是去污剂，且其 在其（一个或多个）亲水基团（有时被称为"头"）中不具有带电荷的基团。非离子型表面 活性剂可以选自去污剂诸如聚山梨醋，诸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60、聚 山梨酯-80、超级精制的聚山梨酯（其中术语"超级精制的"由供应商Croda针对他们的高 纯度吐温产品而使用）、泊洛沙姆诸如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407、聚氧乙烯脱水山梨糖 醇脂肪酸酯、聚氧乙烯衍生物诸如烷基化的和烷氧基化的衍生物（吐温，例如吐温-20或吐 温-80)， 如本文所使用的术语"助表面活性剂"是指当存在第一种表面活性剂时添加至组合物 或制剂中的额外表面活性剂。
[0054] 如本文所使用的术语"渗透增强剂"是指促进药物的吸收的生物品或化学品。
[0055] 术语"增强剂"当测试FA-aa增加给定GH化合物的AUC的能力时使用。GH化合物 的AUC在测试化合物（增强剂）存在的情况下测量，并且与增强剂（测试化合物）不存在 的情况下测量的AUC进行比较。
[0056] 如本文所使用的术语"防腐剂"是指，加入药物组合物中以防止或延迟微生物活动 (生长和代谢）的化合物。药学上可接受的防腐剂的实例是苯酚、间甲酚以及苯酚和间甲酚 的混合物。
[0057] 如本文所使用的术语"微乳预浓缩物"是指这样的组合物：其在口服施用后，在含 水介质中（例如水中或胃肠液中）自发形成微乳或纳米乳（例如，水包油微乳或纳米乳、溶 胀胶束、胶束溶液）。在含水介质中以例如1: 5、1:10、1:50、1:100或更高的稀释度稀释后， 所述组合物自乳化。在一个实施方案中，根据本发明的组合物形成微乳或纳米乳，其包含直 径大小小于l〇〇nm的颗粒或域（domain)。如本文所使用的术语"域大小"或"粒径"是指重 复散射单位，且可以通过例如小角度X-射线来测量。颗粒/微滴大小可以基于动态光散射 (DLS)，其估计分散颗粒或微滴的平均直径。在本发明的一个实施方案中，所述域大小小于 150nm，在另一个实施方案中，小于100nm，且在另一个实施方案中，小于50nm，在另一个实 施方案中，小于20nm，在另一个实施方案中，小于15nm，诸如约12nm〇
[0058] "SEDDS"（自乳化药物递送系统）在本文中被定义为亲水组分、表面活性剂、任 选的助表面活性剂或脂质组分和治疗性大分子的混合物，在轻轻搅拌或将在胃