已知的基于膜的分离技术。
[0313] 生长激素化合物 1 (GH-A1) :GH(Q84C Y143C) 生长激素化合物2 (GH-A2):GH(Q84C Y143C L101C)与白蛋白结合剂
GH-A2的白蛋白结合剂 Rl= hGH (Q84C Y143C L101C)中 L101C 的 S 生长激素化合物3 (GH-A3): GH(Q84C Y143C L101C)与白蛋白结合剂
GH-A3的白蛋白结合剂 Rl= hGH[Q84C Y143C L101C)中 L101C 的 S。
[0314] 实施例7 纯化的生长激素化合物的蛋白化学表征 采用MALDI-MS分析完整的纯化蛋白。实测质量等于自氨基酸序列推导的理论质 量。在二硫键用DTT还原之前和之后，通过采用胰蛋白酶和AspN消化，随后对消化物进行 MALDI -MS分析对肽作图，来表明连接二硫键。
[0315] 纯化的生长激素化合物的浓度测定 使用 Vydac 218TP54 4. 6 mm x 250 mm 5 Mm C-18 硅胶柱（The Separations Group, Hesperia)，在Agilent 1100系统上进行RP-HPLC分析。在214 nm处通过UV检测。柱用 0. 1%三氟乙酸/H20平衡，样品通过0-90%乙腈针对0. 1%三氟乙酸/H20的合适梯度洗脱。 使用已知浓度的hGH标准品的校准曲线计算hGH化合物样品的浓度。
[0316] 采用NanoDrop ND-1000 UV-分光光度计，通过在280 nm处测量吸光度，来估算蛋 白浓度。
[0317] 大小排阻层析在使用 TSK2000 SWXL 7. 5 x 300 mm柱（Tosoh)的 Agilent 1100 系 统上进行。检测通过215 nm的UV。该柱用含有3%异丙醇（30 ml至11流动相）的0. 063 M磷酸盐缓冲液（7. 77 g Na2HP04 2H20 和 5. 28 g NaH2P04 H20 至 11 流动相）pH7. 0(用 磷酸调节）平衡，所述磷酸盐缓冲液也用作洗脱缓冲液。对于每个样品，将20 ul注射在柱 上。使用已知浓度的hGH标准品的校准曲线用于计算hGH化合物样品的浓度。单体、二聚 体和多聚体蛋白的量被确定为曲线下总面积的百分比。
[0318] 所用化合物的短名称、长名称和IUPAC名称的列表在下面提供。
[0319] 实施例8 GH化合物向大鼠的肠道内施用和血液样品的分析 生长激素化合物（129/130、150或300 nmol/大鼠）根据实施例9-19配制，且结果呈 现在表A-K和图1-7中。将每种组合物制备为100 y 1剂量，所述剂量注射到完全麻醉的 过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠（n = 6、9或18)的空肠中段。将GH与FA-aa的浓度比 调整至约1:1 (W: W)，但包括6:1至1:2的变化。
[0320] 在每一取样时间，用25 G针从尾静脉抽取0. 25 mL血液。米样时间为：给药前 和给药后0. 25、0. 5、1、2、4和6小时。将血液采样到EDTA包被的试管中，并储存在冰上，直 至4° C 1200 x G离心10 min。将血浆转移至Micronic管并储存于-20° C直至分析。
[0321] 使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为捕捉剂，生物素化hGH结合蛋白（人GH受体的可 溶性部分）作为检测剂，通过夹心ELISA测定测试化合物浓度。该测定的检测限值为0.2 nM〇
[0322]使用WinNonlinProfessional(PharsightInc.，MountainView，CA，USA)对 每种测试化合物的平均浓度-时间概况进行非房室型药代动力学分析。计算终末半衰期 (t%)和平均保留时间（MRT)的药代动力学参数估计值。
[0323] 采用化学发光氧通道免疫测定法（Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay，LOCI)(基于均质珠粒的测定法)分析样品。LOCI试剂包括两种乳胶珠粒试剂 和生物素化的GH结合蛋白，其是夹心的一部分。珠粒试剂之一是通用试剂（供体珠粒），用 链霉抗生物素包被并含有光敏染料。第二珠粒试剂（受体珠粒）用构成夹心的抗体包被。 在测定过程中，三种反应物与分析物组合形成珠粒-聚集体-免疫复合物。照射复合物从 形成通往受体珠粒的通道的供体珠粒上释放单线态氧，并引发化学发光，其在EnVision读 板仪中测量。所产生的光的量与hGH衍生物浓度成比例。药代动力学概况从所得记录进行 检索。
[0324] 此类药代动力学曲线的实例显示于图1中。显示实施例中测试的增强剂是 C16-G1U，并且生长激素化合物2 (GH-A2)的血浆浓度在有或没有如上所述的增强剂的情况 下施用后进行测量。
[0325] GH吸收程度基于药代动力学概况被定量为AUC(曲线下面积）。在以下实施例中， 增强的程度已被计算为在增强制剂存在的情况下的AUC除以在增强制剂不存在的情况下 的AUC。如图1中显示的C16-G1U的效果也被实施例11覆盖。
[0326] 实施例9 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物l(GH-Al) (300 nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 6. 5)中。 将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠（n = 6)的空肠中段，并且如实施 例8中所述检索药代动力学概况，并计算增强的程度。结果显示在表A中。
[0327] 轰1
[0328] 实施例10 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A1 (300nmol/大鼠）溶解于缓冲液：20mg/ml甘氨酸，2mg/mlD-甘露醇，2.4mg/ml碳酸氢钠， pH=8. 2,存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大 鼠（n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。 结果显示在表B中。额外研宄使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液（包括例如 20mg/ml甘氨酸，2mg/mlD-甘露醇，2.4mg/ml碳酸氢钠，pH=8. 2;50mM磷酸钠缓冲 液pH 7.5; 10mM磷酸钠缓冲液pH 6.5和50mM磷酸钠缓冲液pH 6)来进行。获得结果 的平均值呈现在图2中。
[0329] ^ B
[0330] 实施例11 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (150 nmol/大鼠）溶解于缓冲液：20mg/ml甘氨酸，2mg/mlD-甘露醇，2.4mg/ml碳酸氢钠， pH=8. 2,存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大 鼠（n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。 结果显示在表C中。额外研宄使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液（包括例如 20mg/ml甘氨酸，2 mg/ml D-甘露醇，2.4mg/ml碳酸氢钠，pH=8.2和10 mM磷酸钠缓 冲液pH 6. 5)来进行。获得结果的平均值呈现在图3中，而图1包括来自实验重复（n=18) 的数据。
[0331]
[0332] 实施例12 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A3 (300 〇1/大鼠）溶解于缓冲液：2〇11^/1111甘氨酸，2 11^/1111〇-甘露醇，2.411^/1111碳酸氢钠， pH=8. 2,存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大 鼠（n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。 结果显示在表D中。额外研宄使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液进行。获得 结果的平均值呈现在中。额外研宄使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液（包括 20mg/ml 甘氨酸，2 mg/ml D-甘露醇，2. 4mg/ml 碳酸氢钠，pH=8. 2 ;50 mM 磷酸钠，50 mM NaCl，pH 8;和10 mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5)来进行。获得结果的平均值呈现在图4 中。
[0333]表 D
[0334] 来自实施例9-12的体内数据表明，与在增强剂不存在的情况下测量的GH化合物 的AUC相比，所有增强剂都增加GH化合物的AUC。该数据进一步表明，GH化合物吸附的程 度受脂肪酸酰化的氨基酸的身份影响。对于具有较长脂肪酸链的FA-aa观察到最强效果， 并且所述效果进一步，在一定程度上，取决于具体氨基酸。
[0335] 实施例13 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的含水制剂。将生长激素 化合物GH-A2 (150nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸和大豆胰蛋白酶抑制 剂（SBTI) 2%的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 8. 2)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的 Sprague-Dawley大鼠（n = 12)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并 计算增强的程度。结果显示在表E中。
[0336]
[0337] 实施例14 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的含水制剂。将生长激素 化合物GH-A1、GH-A2和GH-A3 (150 nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸和大豆 胰蛋白酶抑制剂（SBTI) 2%的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 6. 5)中。将组合物注射到麻醉的 过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠（n = 6-12)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药 代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表F中。额外研宄使用相同的FA-aa和GH 化合物使用替代缓冲液进行。测试的含水缓冲液包括20mg/ml甘氨酸，2 mg/ml D-甘露 醇，2. 4mg/ml碳酸氢钠，pH=8. 2 ;10 mM磷酸钠，pH 8. 2和10 mM磷酸钠，pH 6. 5。使 用GH-A1、GH-A2和GH-A3、FA-aa和抑制剂获得的结果的平均值分别呈现在图5、图6和图 7中。
[0338]
[0339] 体内数据表明，脂肪酸酰化的氨基酸（此处为C16-肌氨酸）的GH吸附增强效果 受酶抑制剂的存在显著改善。如图5、6和7中所见，添加蛋白酶抑制剂（SBTI)与FA-aa增 强剂的组合的效果大于所有三种GH化合物的累加效果。
[0340] 实施例15 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的非含水制剂。植物油和表面活性剂的重量 比为30-50 wt%油和50-70 wt%表面活性剂的混合物用作在脂肪酸酰化的氨基酸存在的情 况下的生长激素化合物2的溶剂。将组合物（150 nmol/大鼠）注射到麻醉的过夜禁食的 Sprague-Dawley大鼠（n =8)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并 计算增强的程度。结果显示在表G中。
[0341]表 G
[0342] 总之，FA-aa同样在非含水制剂中作为GH的吸收增强剂也是有功能的。
[0343] 实施例16 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的非含水制剂。双甘油单辛 酸醋、吐温20和丙二醇（45wt%、30wt%、15wt%、10%水）的混合物用作在脂肪酸酰化的氨基 酸和蛋白酶抑制剂存在的情况下的生长激素化合物2的溶剂。将组合物（150 nmol/大鼠） 注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠（n = 9)的空肠中段，并且如实施例8中所 述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表H中。
[0344]表 H
[0345] 该数据表明，除了 SBTI以外的其他蛋白酶抑制剂可以有效增强FA-aa的效果。
[0346] 实施例17 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (129 nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 8. 2)中。将组合 物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段，并且如实施例8中所述检索 药代动力学概况并计算增强的程度。AUC值是所有测试动物中的平均值。结果显示在表1 中。
[0347] 轰I
[0348] 实施例18 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素含水制剂。将生长激素化合 物GH-A2 (129 nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8. 2)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段，并且如实施 例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。AUC值是所有测试动物中的平均值。 结果显不在表J中。
[0349]表.T
[0350] 实施例19 测试含有脂肪酸酰化的氨基酸且有和没有蛋白酶抑制剂的含水制剂。将人生长激素 (129 nmol/大鼠）溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.2)中。 将有或没有抑制剂的组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段， 并且检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表K中。AUC值是所有测试动物 中的平均值。
[0351]
[0352] 实施例20 在E12单层测定中测量含有脂肪酸酰化的氨基酸的含水制剂中GH化合物的跨上皮转 运。
[0353] 转运研宄如通用方法D(实施例1)中所述进行。测试通过将400沿测试溶液（转 运缓冲液中的100剛GH A1化合物、0. 5 mM脂肪酸酰化的氨基酸和0. 4 MCi/rt [3H]甘露 醇）添加至供应室且将1000耵转运缓冲液添加至接受室而起始。在添加GH-A1或GH-A2 化合物之后，将由含有10 mM HEPES，0.1%的Hank氏平衡盐水溶液组成的转运缓冲液调节 至pH 7.4。测量在不同的FA-aa存在的情况下生长激素化合物的渗透（Papp)，并且计算与 单独的生长激素化合物相比的增加（或减少）倍数。
[0354] 表L包括GH-A1和各种脂肪酸酰化的氨基酸的测试组合的结果。
[0355] L
[0356] 基于相对于单独的GH A1的增加倍数，显示与C16-Gln或C16-G1U的组合对GH A1 转运具有最大效果，而C14_aa和C12 FA-aa的使用具有中间效果。
[0357] 在进一步系列的渗透实验中，GH-A2的转运使用如上所述的相同程序进行评估。表 M包括GH-A2和各种脂肪酸酰化的氨基酸的测试组合的结果，其显示相对单独的GH A2的增 加倍数。
[0358] 表 M
[0359] 如上述，对于GH A2的转运，与C16_Gln或C16-G1U的组合被显示具有最大效果， 而与C14-和C12 FA-aa的组合具有中等效果，且与C10-和C12 FA-aa的组合几乎没有效 果。
[0360] 结果因此对于GH-A1和GH-A2是类似的，其表明C16-G1U和C16-Gln对于生长激 素化合物具有优异的渗透效果。C14和C12脂肪酸氨基酸对于生长激素化合物具有中等效 果，而C8和C10对于生长激素化合物的跨上皮转运具有非常温和（modest)的效果（如果 有任何效果的话）。
[0361] 发现体外数据与体内数据相当一致：其显示渗透增强取决于脂肪酸链长度，并且 在一定程度上取决于脂肪酸氨基酸的氨基酸残基。
【主权项】
1. 药物组合物，其包含： a. 生长激素化合物，和 b. 至少一种脂肪酸氨基酸（FA-aa)或其盐，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有12-18 个碳原子。2. 根据权利要求1的药物组合物，其中所述组合物是口服药物组合物。3. 根据权利要求1和2的药物组合物，其中至少一种脂肪酸氨基酸（FA-aa)具有通式：其中R1是包含10-18个碳原子的脂肪酸链， R2是H(即氢）、CH3 (即甲基）或当R2共价连接至R4时是价键，且 R3是H或不存在，且 R4是氨基酸侧链，包括_ (CH2) 3_，此时共价连接至R2。4. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有至少 14个碳原子。5. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有多至 16个碳原子。6. 根据前述权利要求中任一项的口服药物组合物，其中所述脂肪酸部分是衍生自棕榈 酸的棕榈酰基。7. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选 自以下的氨基酸：天冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)、肌氨酸（Sarc)、甘氨酸（Gly)、谷氨酰胺 (Gin)、天冬酰胺（Asn)、丝氨酸（Ser)和苏氨酸（Thr)。8. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述氨基酸残基是谷氨酰胺、谷氨 酸或肌氨酸。9. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述脂肪酸酰化的氨基酸为N-棕 榈酰基-谷氨酸钠或N-棕榈酰基-肌氨酸钠。10. 根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物具有高于30 分钟的T%。11. 用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法，其包括在所述生长激素化合物的 药物组合物中包括FA-aa的步骤。12. 用于增加生长激素化合物的血浆浓度的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道 暴露于包含生长激素化合物和FA-aa的药物组合物，导致所述个体中所述生长激素化合物 的血浆浓度增加。13. 用于增加生长激素化合物的摄取的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露 于生长激素化合物和至少一种FA-aa，由此，与不包括至少一种FA-aa的暴露相比，所述个 体中所述生长激素的血浆浓度增加。14. 用于治疗生长激素相关的疾病或病症的方法，其包括施用包含生长激素化合物和 至少一种FA-aa的药物组合物。15. 权利要求11-14的方法，其中所述药物组合物通过权利要求1-10中任一项进行描 述。
【专利摘要】本发明涉及包含脂肪酸酰化的氨基酸(FA-aa)的生长激素组合物，其可以用于药物组合物，诸如用于口服施用生长激素的药物组合物。
【IPC分类】A61K38/27, A61K47/16, A61K31/185, A61P5/06
【公开号】CN104955472
【申请号】CN201380054126
【发明人】M.雷斯洛, L.诺斯科夫-劳里特森, H.W.巴格, C.B.施奥德特
【申请人】诺和诺德保健股份有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年10月17日
【公告号】EP2908845A1, US20150250882, WO2014060512A1