。
[0054] 1. 3标准曲线的绘制
[0055] 分别精密吸取尿囊素标准品溶液20 μ L，分别进样，按照上述色谱条件测定尿囊素 标准品对照峰的峰面积，以峰面积对进样质量回归，绘制标准曲线，得到线性回归方程。Y = 5282. 2Χ+0. 9701;R2 = 0. 9972。
[0056] 1. 4供试品溶液的制备
[0057] 分别精密称取实施例1、实施例2及实施例3样品7. 74mg，用40%甲醇定容至ImL 作为母液备用，再用40%甲醇稀释至浓度为0. 3870mg/mL作为供试品备用。
[0058] 1. 5山药皮提取物A中尿囊素的含量测定
[0059] 分别精密吸取实施例1、实施例2及实施例3供试品溶液各20 μ L，分别进样，按照 上述色谱条件分别测定实施例1、实施例2及实施例3中山药皮提取物A样品的峰面积，根 据标准曲线得出各自浓度，计算得尿囊素含量，结果如图1、图2、图3和表1。
[0060] 表1山药皮提取物中尿囊素含量
[0062] 2山药皮提取物中总皂苷的含量测定（紫外分光光度法）
[0063] 2. 1标准曲线的绘制
[0064] 分别吸取0、0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5ml薯蓣皂苷对照品溶液，置于IOml试管 中，挥干甲醇，加〇. 2ml配置的5%香草醛冰醋酸溶液，0. 8ml高氯酸，70°C水浴，20min。立 即冷却，加5ml冰醋酸，摇匀。第一个试管做空白，485nm下测定吸光度。得线性方程y = 4. 3450x+0. 0013 ;R2= 0. 9984。
[0065] 2. 2样品总皂苷含量测定
[0066] 分别制备实施例1、2和3的山药皮提取物的供试品溶液，吸取供试品溶液 0. 025mL，挥干溶剂，加0. 2mL配置的5 %香草醛冰醋酸溶液，0. 8mL高氯酸，水浴70°C， 20min。立即冷却，加5mL冰醋酸，摇匀。第一个试管做空白，485nm下测定吸光度。实验结 果见表2。2. 3实验结果
[0067] 表2山药皮提取物中总皂苷含量
[0069] 3山药饮片提取物中可溶性多糖含量测定（紫外分光光度法）
[0070] 3. 1标准曲线的绘制
[0071] 取7支25mL刻度试管，编号，依次加入100 μ g · mL-1鹿糖标准溶液0mL、0. 2mL、 0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、lmL、l. 2mL，之后按顺序加入蒸馏水定容至2mL，混勾后加入5mL蒽 酮-硫酸溶液（〇. 2g蒽酮溶于IOOmL浓硫酸），充分振荡，立即将其放入沸水浴中加热，保温 lOmin，取出后冷却至室温，以1号试管为空白对照，在波长620nm处比色，以吸光度为纵坐 标，蔗糖质量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y = 5. 5075x+0. 0435 ;R2= 0. 9915。
[0072] 3. 2可溶性多糖含量测定
[0073] 称取0. 5g饮片提取物粉末，配置成浓度为1.0 mg/ml的样品溶液。取0. 5mL加入 到25mL的刻度试管中，加水定容至2mL，混匀后加入5mL蒽酮-硫酸溶液，充分振荡，立即将 其放入沸水浴中加热，保温lOmin，取出后冷却至室温，在波长620nm处比色测定。
[0074] 3. 3实验结果
[0075] 表3山药饮片提取物中可溶性多糖含量
[0077] 药效试验
[0078] 1.试验方法
[0079] I. 1小鼠 H22肝癌、艾氏腹水瘤（EAC)
[0080] 接种7天，生长良好的H22、EAC腹水瘤小鼠脱颈椎处死，剪开腹部皮毛，用5mL注 射器抽取腹水瘤细胞悬浮于离心管中，调整细胞浓度至I. 0 X 106/mL。取0. 2mL肿瘤细胞悬 浮液接种于小鼠右前肢腋下，造模24h后分组、给药14天。
[0081] L 2人源H印G2肝癌
[0082] 无菌条件下，取生长约一个月的荷瘤小鼠的实体瘤，剪取生长良好（色泽似鱼肉） 的瘤体，剪成长约5mm的正方体小块接种于裸鼠右侧腋窝处皮下。造模后一周，根据肿瘤大 小分组、给药30天。
[0083] 试验结束后，取动物肿瘤、脾脏和胸腺（裸鼠无胸腺），计算肿瘤抑制率及脏器指 数。抑瘤率（％) = (1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重）Χ1〇〇%，摘取脾，胸腺，并称 重。脾指数=(脾脏重量/体重）*1000,胸腺指数=(胸腺重量/体重）*1000。
[0084] 2.试验结果
[0085] 表4体内抗肿瘤活性试验结果
[0086]
[0089] 注：与模型组相比，*Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01
[0090] 体内抗肿瘤活性试验结果表明，山药皮提取物和山药饮片提取物所组成的组合物 的抑瘤效果显著增强。
[0091] 实验结果根据Webb氏分数乘积法计算，Webb氏分数乘积公式如下：（fa) 12 = l-tMfahHMfa)」，（faKfa)^别为两药的抑瘤率，（fa) u为计算的理论相加效应。 如果合并用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果显示组合物组的实测抑瘤值大 于理论抑瘤值，证明将山药皮提取物A和山药饮片提取物B进行组合后具有协同增效作用。 并且山药皮提取物A和山药饮片提取物B组合后在提高小鼠免疫功能器官（脾指数、胸腺 指数）方面与模型组相比具有显著性差异（P < 0.05)。从而达到了很好的提高机体免疫效 果。
[0092] 三、结论
[0093] 本发明提供的抗肿瘤的中药组合物制备方法简单，药效显著。经鼠源和人源移植 瘤模型试验，结果显示山药皮提取物与山药饮片提取物配伍后抑瘤率显著提高，具有协同 增效作用。同时，小鼠免疫功能指数（脾指数、胸腺指数）提高，能够明显改善荷瘤动物的生 存质量。山药皮提取物主要含尿囊素和薯蓣皂苷，山药饮片提取物主要含多糖，山药皮提取 物抑瘤作用稍强，山药饮片提取物补益作用较佳，两者单独使用药效较弱，而组合应用既可 以提高抗癌作用，又可以提高免疫功能，所以，癌症患者作为功能食品辅助使用非常有益。 [0094] 研宄证明，山药皮提取物及山药饮片提取物在125mg/kg剂量下对H22肝癌荷瘤小 鼠的肿瘤生长抑制率分别约为20%、13%，将山药皮及山药饮片提取物组合后，在125mg/ kg剂量下抑制率提高到约31%。说明山药饮片或山药皮提取物单独使用无法达到满意的 抗癌效果，这可能正是人们对山药的抗癌研宄较少的原因之一。在山药饮片的工业生产中， 山药皮一般作为废物丢弃，本申请通过对山药皮进行提取，发现其中所含尿囊素和薯蓣皂 苷含量高于山药饮片，遂通过药理试验证明山药皮提取物和山药饮片提取物组合后抗癌功 效明显提升，并具有开发成为与癌症相关的药品或保健品的潜能。
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤作用的山药提取物组合物，其特征是由质量比1:10~20的山药皮 提取物与山药饮片提取物组成。2. 根据权利要求1所述的一种抗肿瘤作用的山药提取物组合物，其特征在于所述山药 皮提取物和山药饮片提取物的质量比为1:15。3. 根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤作用的山药提取物组合物，其特征在于 所述山药皮提取物由下述方法提取：将洗净的厚度为0. 5~Imm的山药皮放在80~90°C 的热水中焯，捞出后于40-60°C条件下烘干，粉碎，用6~12质量倍的体积比60% -80%的 乙醇水溶液浸泡1~3小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并滤液并浓 缩至无醇味，浓缩液用石油醚或乙酸乙酯萃取，取水相I，水相I再加水饱和正丁醇、萃取， 取水相II，过滤，干燥，得山药皮提取物。4. 根据权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤作用的山药提取物组合物，其特征在于 所述山药饮片提取物由下述方法提取：将山药饮片用6~10倍量体积比95%的乙醇水溶 液回流1-2次，每次l_2h，过滤，滤渣干燥，干燥滤渣用10~20质量倍的蒸馏水浸泡1~2 小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并滤液，静置18~24小时，离心， 取上清液，用Sevage法除蛋白，滤液减压浓缩，干燥，干燥物粉碎，过100~200目筛，即得 山药饮片提取物。5. 权利要求1-4之一的具有抗肿瘤作用的山药提取物组合物在制备抗肿瘤药物中的 用途。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的山药提取物组合物及用途，该组合物是由质量比1:10～20的山药皮提取物与山药饮片提取物组成。本发明的组合物通过动物体内试验证明具有抗癌功效。对小鼠H22肝癌、艾氏腹水瘤(EAC)和人源HepG2肝癌抑制率均在35％以上，具有明显抗癌功效。并且，动物的免疫器官指数如脾指数和胸腺指数明显提高，证明本发明的组合物在抑制肿瘤生长的同时可以提高机体免疫功能。
【IPC分类】A61P37/04, A61P35/00, A61K36/8945
【公开号】CN104984009
【申请号】CN201510437939
【发明人】高文远, 刘元雪, 李红法, 满淑丽, 刘振, 范亚亚
【申请人】天津大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月23日