温1-2 h后，1500 g，4°C离心10 min，收集和分装血清，- 80°C冻存。
[0134] 2)包被抗原：96孔板每孔滴加100 PL PBS稀释的SIVmac239全病毒裂解物（5 Kg/mL)，并于4°C包被过夜。
[0135] 3)洗板：次日倒掉抗原，甩干，PBS洗涤3次，每次间隔3 min。
[0136] 4)封闭：加入 5% 脱脂奶粉-PBST(0· 5/1000 Tween-20)，每孔 20〇μL，37°(：封闭 1-2 h〇
[0137] 5)洗板：每孔加入200 μL PBST，洗5次，3 min/次，保湿保存备用。或者直接进 入下一步检测实验。
[0138] 6)加入待测血清（封闭液稀释）：每孔加入100 μL，每个样品做双孔测定，37°C反 应2 h〇
[0139] 对于IgG检测，血清按1:100-1:12800稀释； 对于IgA检测，血清按1:50-1:3200稀释； 7)洗板：每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗5次。
[0140] 8)结合第二抗体（用封闭液稀释）：每孔加入100 μL稀释的HRP-二抗，37°C孵 育I ho
[0141] SouthernBiotech HRP Anti-mice IgG (γ chain specific)： 1:4000； SouthernBiotech HRP Anti-mice IgA (a chain specific) ： 1:4000; 9)洗板：每孔加入200 μL PBST，3 min/次，洗5次。
[0142] 10)显色：每孔加入100 μL酶反应底物TMB，37°C放置5-10 min。
[0143] 11)加入等体积的IM的H2S04终止反应· 12)结果测定：用酶标板分光光度仪在450 nm波长测定0D450值。
[0144] 13)抗体滴度分析。
[0145] ELISP0T检测分泌IgG的B淋巴细胞（ASC)比例的具体操作步骤为： 1) 实验前的一天，ELISP0T板用50 μι/孔35%乙醇润湿活化I min，然后用200 μι/ 孔PBS润洗6次。按一下浓度包被PBS稀释的抗原或者抗体，50 μL/孔加到96-well PVDF 板，4°C包被过夜。
[0146] SIVmac239 gpl40蛋白抗原：包被浓度为20 Pg/ml，用无菌PBS (ρΗ7· 4)稀释； 羊抗鼠二抗(无 HRP标记）：包被浓度为30 Pg/ml，用无菌PBS (ρΗ7. 4)稀释； 2) 次日，甩去液体，用无菌PBS洗涤3次后，每孔加入200 μL RlO完全培养基，37°C封 闭至少2 h。期间，分离小鼠淋巴细胞。
[0147] 3)弃封闭液，每孔加入100 μL脾脏或骨髓单细胞悬液用于检测抗原特异性的浆 细胞分泌抗体的能力，其中抗原特异性浆细胞实验中，脾脏和骨髓的细胞数目均为IX 1〇6， 而非特异性的总B淋巴浆细胞实验中，脾脏和骨髓的细胞数目均为I. 5 X ΙΟ5。
[0148] 4)或将细胞刺激培养用于检测记忆性B细胞：取I. 5 X IO6脾细胞或骨髓细胞到 24孔板，每孔加入2 11111?10，含有鼠11^-2(10〇1111行/1111)和1?848(1 以8/1111，七141848， invivoGen)。37°C，5% C02培养箱中培养3天后，吹打均匀细胞。用RPMI 1640培养液洗 涤1次后，以5 X IO5细胞数/孔铺96孔板板，总IgG分泌B细胞则以5 X 10 4细胞数/孔铺 板。
[0149] 5) 37°C，5% CO2培养箱中孵育 12-16 h。
[0150] 6)扣弃细胞悬液，用无菌PBST 200 μL/well洗涤5次，每次3 min。甩去洗液， 在无菌干燥纸上扣干。
[0151] 7)用含5% FBS的PBST按1:1000稀释HRP标记的羊抗鼠 IgG二抗，100 μL/孔， 置于37°C反应2 h。
[0152] 8)用无菌PBST 20〇μ1/孔洗涤5次，每次3 min。甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干 9)配置HRP显色底物（Sigma，AEC101)，以100 μL/孔添加；室温（25°C左右）下避光反 应10-20 min或者37°C下反应10 min左右。
[0153] 10)弃去底物，用水洗涤2-4次。风干读板。实验结果分析。
[0154] 2 结果 检测结果如图7所示，虽然骨髓B淋巴浆细胞的数目在高剂量25-OHC处理下呈现出 减少的趋势，但这并不影响脾脏B淋巴浆细胞的形成（图7 A和B)。而且，即使是高剂量的 25-OHC也未干扰记忆性B淋巴细胞的产生（图7 C和D)。ELISA检测结果表明，高剂量的 25-OHC不会明显影响SIVmac239特异性结合抗体的产生（图7 E)。抗原特异性IgA含量非 常低以致难以通过ELISA检测出（未列出结果)。这些数据进一步揭示了 250HC在小鼠获得 性免疫应答中的重要性，尤其在免疫精确调控上量效控制的必要性。
[0155] 上述结果说明在抗病毒(如HIV)感染过程中，25-OHC或CH25H作为疫苗的免疫调 节剂促进疫苗的免疫原性，显著降低了⑶4+ T淋巴细胞分泌TNF-a、IL_2细胞因子的能力， 降低了 CD4+ T淋巴细胞的易感性，同时25-OHC或CH25H作为免疫调节剂并不影响小鼠生长 及其它生理指，也不影响记忆性B淋巴细胞的产生以及抗原特异性IgG抗体的产生水平。由 于B淋巴细胞的分化和抗体的产生及亲和力成熟对控制艾滋病感染也是十分重要的，因此 在注射疫苗期间使用25-OHC或CH25H作为免疫调节剂，可保证疫苗诱发中和抗体的能力。
[0156] 实施例4:Ch25h基因作为疫苗的免疫调节剂的应用 在上述实施例中，我们使用25-OHC作为具体的实施例进行研究，由于它是化学小分子 药物，来源和使用都很方便，因此我们优先将其作为实施例。然而其在体内代谢周期很快， 为了保证其作用效果，需在疫苗注射期间连续使用（图4A)。事实上，25-OHC是CH25H的 代谢产物，而编码CH25H蛋白的基因是Ch25h。本发明还构建了表达Ch25h的重组腺病毒 Ad5-Ch25h，图8为构建Ad5-Ch25h重组腺病毒的示意图（图8A)及相应的电泳检测验证图 (图8C~D)。在本实施例免疫疫苗时，同时注射Ad5-Ch25h重组腺病毒，经检测可在体内长 时间表达出CH25H酶，进而产生代谢产物25-OHC。根据本领域熟知的知识，可预期其将其 到与实施例3同样的效果，即在注射艾滋病疫苗时同时使用Ad5-Ch25h (IO11病毒颗粒/剂 量)作为免疫调节剂，可抑制体内的艾滋病毒感染的靶细胞抗原(特异性CD4+ T淋巴细胞分 泌IL-2和TNF-α的能力)，且同时不影响杀伤性⑶8+ T淋巴细胞和中和抗体的产生。从而 可以有效提升艾滋病疫苗的免疫应答类型和免疫保护效果。因此Ch25h基因也能作为疫苗 的免疫调节剂。
[0157] 综上所述，25-OHC和CH25H能调节机体的天然免疫应答和特异免疫应答，例如它 能够有效抑制炎症反应，包括抑制IL-I β和TNF-α验证因子的表达；它能在不影响抗原特 异性T淋巴细胞增殖的情况下，强烈抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞过度增殖效应；它可 显著弱化艾滋病毒特异性CD4+ T淋巴细胞免疫应答，但与此同时却对特异性CD8+ T淋巴 细胞应答、B淋巴细胞和抗体无明显影响。该发明表明25-OHC能显著降低病毒感染所导致 的炎症反应、过度的细胞增殖和激活；而且它们也可作为免疫调控佐剂应用于研发新型有 效的艾滋病疫苗。
[0158] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种免疫调节剂，其特征在于：该免疫调节剂为胆固醇-25-羟化酶的编码基因、胆 固醇-25-羟化酶、25-羟基胆固醇中的至少一种。2. 权利要求1所述免疫调节剂作为疫苗的免疫调节剂的应用。3. 根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：所述疫苗为艾滋病疫苗。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的艾滋病疫苗中抗原的基因选自 gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev 中至少一f中。5. 根据权利要求2~4任一所述的应用，其特征在于：所述疫苗的形式为重组蛋白疫 苗、重组质粒DNA疫苗或重组病毒载体疫苗。6. 权利要求1所述免疫调节剂在制备防治炎症药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的炎症为脂多糖引起的炎症。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的炎症为病毒引起的炎症。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的病毒为HIV。10. 根据权利要求6~8任一所述的应用，其特征在于：所述的炎症为炎症应答、非特 异细胞增殖中的至少一种。
【专利摘要】本发明公开了CH25H与25-OHC在免疫应答中的作用及其作为免疫调节剂在疫苗中的应用，本发明发现了25-OHC能显著抑制炎症免疫反应，其可抑制免疫细胞过高表达的IL-1b和TNF-a，对病毒感染患者持续性免疫活化和炎症反应的调节有很重要的应用价值；25-OHC能在不影响抗原特异性T淋巴细胞增殖的情况下，强烈抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞过度增殖效应；将25-OHC作为HIV疫苗的免疫调节剂，提高疫苗的免疫效果，可普遍用于预防和治疗艾滋病。以上所述的免疫调节作用有助于新一代HIV疫苗的设计，即在不影响机体保护性CD8+T细胞免疫功能的情况下，尽量降低CD4+？T细胞免疫应答。
【IPC分类】A61P31/18, A61K31/575, A61P37/02, A61K39/21, A61K38/44, A61K48/00
【公开号】CN104998275
【申请号】CN201510359101
【发明人】孙彩军, 陈凌, 吴同金
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年6月25日