8A和8B所示，未配制的抗体迅速地从滑液中清除并进入血清，这导致了 12小时后 的相对低的滑液浓度和高的全身暴露。给药后2小时在节点处看到了相对高浓度的抗体。 给药约10小时内，在滑液中的生物治疗剂的局部浓度下降了约两个数量级，且生物治疗剂 的血清暴露是相对高的。
[0128] 5. 3 实施例 3
[0129] 制备10%、15%和20%重量体积比的用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1 :1比例官能 化的8-臂PEG和以1 :25比例（生物治疗剂比PEG固体）的ABT-308的溶液。聚合物链的 分子量是l〇kDa。这些溶液的一半与激活缓冲液混合以形成交联的组合物。溶液的一半是 预混合的。预混合的溶液由溶解于悬浮缓冲液中的PEG固体组成，其与溶解于激活缓冲液 的生物治疗剂混合以形成交联的组合物。体外观察到交联的组合物，并确定孵育头4小时 的生物治疗剂的初始释放。如图9A所示，从预混合的交联的组合物释放了平均6. 8%的生 物治疗剂，从未预混合的20% PEG交联的组合物释放了平均7. 9%的生物治疗剂。预混合 的交联的组合物观察到的生物治疗剂的初始释放低至3%。图9B提供了根据所公开的主 题的一个方面的示例性三相释放曲线。图14A和14B示出了实验中的所有体外释放数据。 PEG固体从10%增加至15%似乎降低了 mAb释放的速率。
[0130] 进行另外的延长释放的体外分析，其中评估了预混合的8-臂、4-臂和混合的8-臂 /4-臂PEG凝胶的受控释放曲线。通过混合下述物质来形成交联的组合物：用硫醇基团或 丙烯酸酯基团以1 :1比例官能化的8-臂PEG和以1 :25比例（生物治疗剂比PEG固体）的 ABT-308,用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1 :1比例官能化的4-臂PEG和以1 :25比例（生物 治疗剂比PEG固体）的ABT-308，或以25:75、50:50或75:25比例（8-臂PEG比4-臂PEG) 的8-臂和4-臂PEG制剂的混合物。溶液中的PEG的总重量体积比是10%或15%。如图 3A和图3B所示，观察到所有的交联组合物（无论用10 % PEG固体或15 % PEG固体配制的） 都显示出了生物治疗剂的三相释放曲线，其具有0-30天持续时间的初始释放速率，0-30天 持续时间的第二释放速率和0-30天的第三释放速率。第二释放速率大于第一释放速率和 第三释放速率。受控释放的总持续时间从约40天至约80天不等。表1提供了突释效应低 于5%、初始释放小于10%、释放持续时间大于30天且在体外已确认了三相释放曲线的另 外的实施方式。图15A-E和图16A-E分别示出了被平均以产生图3A和图3B的曲线的单独 实验。
[0131] 用20% PEG固体重复上述实验。进行延长释放体外分析，其中评估了预混合的 8-臂、4-臂和混合的8-臂/4-臂PEG凝胶的受控释放曲线。通过混合用硫醇基团或丙 烯酸酯基团以1 :1比例官能化的8-臂PEG和以1 :25比例（生物治疗剂比PEG固体）的 ABT-308,用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1 :1比例官能化的4-臂PEG和以1 :25比例（生物 治疗剂比PEG固体）的ABT-308，或以25:75、50:50或75:25比例（8-臂PEG比4-臂PEG) 的8-臂和4-臂PEG制剂的混合物来形成交联的组合物。溶液中的PEG的总重量体积比是 20%。对预混合的和未预混合的制剂进行研究。如图17A和图17B所示，观察到所有交联的 组合物都显示出了生物治疗剂的三相释放曲线，其具有0-30天持续时间的初始释放速率， 0-30天持续时间的第二释放速率和0-30天的第三释放速率。第二释放速率大于第一释放 速率和第三释放速率。受控释放的总持续时间从约40天至约80天不等。此外，增加8-臂 PEG的比例将提高完整mAb释放和完整凝胶降解之间的延迟。进一步观察到，未预混合的交 联的组合物可以产生更大的突释效应。
[0132] 此外，如图17C所示，用具有溶液中12或20%的总重量体积比的PEG并包含8或 32 μ g/ μ 1的抗体的8-臂预混合的或未预混合的PEG制剂重复上述实验。观察到生物治疗 剂的三相释放长达85天。在100天发生交联的制剂的完全降解。溶液中的总PEG固体越 多，观察到越大的所述的突释。
[0133] 也绘制了溶胀比的曲线，如通过如上所述的制剂的质量相对于交联的组合物的初 始质量随时间变化的增加所确定的溶胀比的曲线图。在图18A和图18B中提供了这些图。 如表8所示，未预混合的交联的组合物比预混合的交联的组合物显著地吸收了更多的水。
[0134] 5. 4 实施例 4
[0135] 将溶解于0. 05M磷酸悬浮缓冲液（pH 3. 5)的用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1 :1 比例官能化的8-臂PEG与0. 16mg标记有荧光团的ABT-308 (单克隆抗体）组合，并溶解于 0.2M的碳酸氢盐悬浮缓冲液（pH 9.0)中。通过吸入并排出（冲排）注射器混合合并的溶 液。将10%总PEG固体和20%总PEG固体二者的溶液混合。5、15或30个注射器冲排后， 在此期间交联反应开始，吸入混合物，允许交联进行至接近完成，排出部分形成的交联的组 合物。交联完成后，在相衬成像和荧光成像下用20倍放大倍率观察交联的组合物。重复了 10 %总PEG固体和20 %总PEG固体的4-臂PEG溶液的实验。令人惊奇地，观察到在整个制 剂中4-臂PEG固体混合物导致了不均匀的沉淀物尺寸和沉淀物的不均匀分布。此外，沉淀 物尺寸随混合冲排的次数而增加，使得由冲排30次所形成的混合物表现出大的、粘性的沉 淀物和不完全沉淀。相比之下，8-臂PEG固体混合物通过5、15或30个冲排混合时表现出 相对均匀的沉淀物尺寸。观察到沉淀物尺寸随冲排的次数的增加而增大。20% PEG固体溶 液表现出在约IOOnm至1 μ m的直径之间的生物治疗剂沉淀物尺寸。这些结果示于图6A、图 6B、图6C和图6D。图6A示出了 10%的4-臂PEG制剂；图6B示出了 10%的8-臂PEG制 剂；图6C示出了 20%的4-臂PEG制剂；图6D示出了 20%的8-臂PEG制剂。
[0136] 5. 5 实施例 5
[0137] 以具有27%单克隆抗体（阿达木单抗）负载（按重量计）的7.91% (按体积计） 或具有32%单克隆抗体（阿达木单抗）负载（按重量计）的6. 29% (按体积计）的浓度 提供了以1 :1比例用硫醇基团或丙烯酸酯基团官能化的4-臂PEG的制剂。将制剂与碳酸 盐激活缓冲液（pH 9.5)混合以形成交联的组合物。观察到溶胀（通过塑料管中高度变化 的百分比所观察到）平行于释放的抗体的百分比。如图4A所示，交联的组合物的溶胀紧密 地与释放的抗体的比例相一致。凝胶的溶胀随时间的变化示于图19。
[0138] 此外，交联具有不同比例的PEG固体浓度、单克隆抗体负载、溶液缓冲液组合物和 官能团的4-臂PEG的制剂以形成交联的组合物。体外孵育交联的组合物并记录各个组合 物的溶解时间（如通过目测检查所确定的）。交联的组合物的组分和相应的溶解时间示于 图4B中。
[0139] 5. 6 实施例 6
[0140] 将15mM组氨酸缓冲液（pH 5. 2)中的或以冻干形式再溶解于缓冲液的4-臂 PEG-Acr/PEG-SH和阿达木单抗的制剂与0. 2M磷酸盐缓冲液（pH 8或pH 10)或0. 2M碳酸 盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.5和pH 10.5)混合。在无菌离心管中形成凝胶，并通过目测检 查（抵抗重力流）来测量胶凝时间。通过在凝胶形成后1小时添加释放介质（含有〇· Iwt% 的吐温80和0. 05wt%的叠氮化钠的PBS，pH 7. 4)并在指定时间间隔取出600 μ L样品来 测量随时间变化的抗体释放。样品体积被立即替换。图20和图21分别描绘了所示的交联 的组合物随时间变化的胶凝时间和抗体释放。结果表明数个变量都影响胶凝时间和mAb释 放。
[0141] 5. 7 实施例 7
[0142] 将ΑΒΤ-308单克隆抗体施用于5组（组Α-Ε)每组9只路易斯大鼠（每组再分成 三只一组的三组）的后肢关节内空间。组A接受0.16mg的未配制的冻干mAb。组B接受 0. 16mg的配制于悬浮于0. 05M磷酸盐缓冲液（pH 3. 5)的8-臂PEG-Acr/SH并与0. 2M的磷 酸盐缓冲液（pH 9. 0)混合的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20%重量体积比提供PEG。 PEG的分子量是IOkDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比例合并；以1:1比例提供悬浮缓冲液 和激活缓冲液。组C接受0. 16mg的在20% 8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。益相对于所 提供的缓冲液计20 %重量体积比提供PEG。将PEG和mAb混合于0. 2M的磷酸盐缓冲液（pH 7. 5)中。PEG的分子量是IOkDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比例合并。组D接受0. 16mg 的以50:50比例的4-臂和8-臂PEG所提供的PEG-Acr/SH中的mAb。以相对于所提供的缓 冲液计20%重量体积比提供PEG。PEG的分子量是IOkDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比 例合并。组E接受0. 32mg的在20% 8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的 缓冲液计20 %重量体积比提供PEG。组A在14天接受滑膜灌洗，而组B-E在1、7和14天 接受滑膜灌洗。图10示出了组C中抗体在14天中的血清和滑液浓度。在实验期间，保持 了相对高的滑膜浓度，而血清暴露最小化。在表5中提供了各个治疗组的滑液浓度、血清浓 度和滑液浓度：血清浓度的比例。在表7中提供了各组的AUC暴露数据。各组和时间点的 平均滑膜和血清的mAb浓度示于图22中。图23A、图23B、图23C和图23D分别提供了治疗 组B、C、D和E的血清和滑液浓度，而图24A、图24B、图24C、图24D和图24E提供了在分别 的研究组中各个个体动物的全身暴露和AUC暴露数据。
[0143] 5. 8 实施例 8
[0144] 将ABT-308单克隆抗体施用于5组（组A-E)每组9只路易斯大鼠（每组再分成 三只一组的三组）的后肢关节内空间。组A接受0.16mg的未配制的冻干mAb。组B接受 0. 16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20 %重量体积比 提供PEG。PEG的分子量是IOkDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比例合并；以1:1比例提供 悬浮缓冲液和激活缓冲液。组C接受0. 16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。相对于 所提供的缓冲液计的20%重量体积比的提供PEG。将PEG和mAb混合于0. 2M的磷酸盐缓 冲液（pH 7. 5)中。PEG的分子量是2kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比例合并。组D接 受0. 16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中所提供的PEG-Acr/SH中的mAb。以相对于所提供的缓 冲液计10%重量体积比提供PEG。PEG的分子量是IOkDa且PEG-Acr和PEG-SH以1 :1比 例合并。组E接受0. 16mg的在8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的缓冲液 计20 %重量体积比提供PEG。组A在14天接受滑膜灌洗，而组B-E在1、7和14天接受滑 膜灌洗。各组的平均滑膜和血清mAb浓度示于图25中，并且表9提供了所有组的血清AUC 总计。
[0145] 用三组重复这一研究。组A接受0. 16mg的未配制的冻干mAb，组D接受0. 16mg的 在10 %的8-臂PEG-AC/SH (悬浮于0. 05M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH 3. 5)并用0. 2M的 碳酸氢盐缓冲液（pH 9)交联）中的mAb，组E接受0. 16mg的在20%的8-臂PEG-AC/SH(悬 浮于0. 05M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH 3. 5)并用0. 2M的碳酸氢盐缓冲液（pH 9)交联） 中的mAb。组A有在14天提取的滑膜灌洗样品，而组D和组E有在1天、7天和14天提取 的滑膜灌洗样品。血清暴露和AUC计算示于图23。表6提供了滑液暴露。分别的治疗组 的结果示于图26A和图26B中。各组的个体动物的结果示于图27A-C中。在图28中提供 了进一步的实验数据，其示出了低于约0. 1的全身浓度与局部浓度的比例维持了至少6周。 表10中提供了相应的AUC数据。
[0146] 5. 9 实施例 9
[0147] 用每以1^组合物8、16、24和32以8的481'-308负载的10(^120%8-臂交联的组 合物评估沉淀的胶凝时间和均匀性。在〇. 2M的磷酸盐缓冲液（pH7. 5)