i USA91:11298-11302)；
[0038]30.Brinster CJj Ryu BY, Avarbock MR, Karagenc Lj Brinster RLj et al.(2003)Restorat1n of fertility by germ cell transplantat1n requires effectiverecipient preparat1n.B1l Reprod 69:412-420(Brinster CJj Ryu BY, AvarbockMR, Karagenc L, Brinster RLj et al.(2003)生殖细胞移植恢复生育能力要求受者做好有效准备.B1l Reprod 69:412-420)。
【发明内容】
[0039]本发明要解决的技术问题是提供一种人宫内膜干细胞的新用途一一在制备治疗卵巢早衰的药物中的应用。
[0040]为了解决上述技术问题，本发明提供一种人宫内膜干细胞人宫内膜干细胞在制备治疗卵巢早衰的药物中的应用。特别是在制备治疗卵巢早衰的细胞药物和医疗技术中的应用。
[0041]通过研究中我们发现，将人宫内膜干细胞移植到化疗药物引起卵巢早衰的小鼠体内有助于促进其卵巢功能的恢复，并且可明显地促进小鼠体重及动情周期的恢复(图2-3) ο此外，交配实验结果显示，在细胞移植组中小鼠的怀孕次数及产仔率虽未能达到正常组，但均明显高于未进行细胞移植的对照组(图4)。
[0042]大量的动物及临床实验表明，通过灌注或移植的方法将间充质干细胞注入体内有助于组织及器官的功能恢复。例如，通过静脉注射后的间充质干细胞可以直接迀移到受损组织或者通过分泌生物活性分子促进组织功能的修复[24]。将骨髓来源的间充质干细胞注入到冠状动脉疾病的小鼠体内，尽管在细胞移植后的第48小时未能检测到供体细胞，但是在治疗3周可明显提高心肌功能[25]。在本发明的实验中，我们还通过活体成像技术观察细胞移植后在体内的分布情况。在细胞移植后的2个月，供体GFP阳性细胞可迀移到卵巢组织并且表达颗粒细胞特有蛋白(FSHR)，因此，我们认为人宫内膜干细胞可分化为卵巢颗粒细胞进而促进卵巢功能的恢复。
[0043]研究显示，化疗药物白消胺及环磷酰胺均可引起人及小鼠的卵巢长时间，且不可逆的损伤。白消胺及环磷酰胺的联合使用引起卵巢凋亡细胞数量的增加及生殖细胞的快速耗竭[26，27]。然而，却很少有研究去观察化疗药物对小鼠体重及其他组织器官的影响。在我们的研究中发现，白消胺及环磷酰胺的联合使用引起雌性小鼠体重明显下降及动情周期的发生改变(图2和图3)。同时，我们也通过HE染色的方法观察化疗药物对其他组织器官的影响，结果发现在化疗后第7天的心肌成纤维细胞发生水肿，肾小球充血及萎缩严重，肝脏有大量炎性细胞浸润及脾组织中有大量淋巴细胞增殖；而在化疗后的第14天，各组织器官的损伤程度都有所缓解(图3)。值得一提的是，化疗药物对卵巢的影响表现最为严重且不可逆，主要包括卵细胞的丢失，卵巢组织的纤维化及不孕[图3、图4C]。以上结果表明，化疗药物主要影响雌性小鼠中卵巢功能。
[0044]白消胺作为一种生殖干细胞毒性药物，在雄性小鼠的精子发生过程中已被广泛研究。研究其对雌雄小鼠出生后卵泡池中生殖干细胞供给的影响也将具有重要意义。在睾丸组织中，白消胺主要影响生殖干细胞及精原细胞，而并不影响有丝分裂后的生殖细胞，最终可导致精子发生异常[28-30]。研究发现，白消胺(30mg/kg)及环磷酰胺(120mg/kg)单次使用即可引起雌性小鼠不孕及生殖干细胞不可逆的丢失。近来，有研究显示可从小鼠及人的卵巢组织中分离获得生殖干细胞，这一结果表明卵巢具有产生新的卵母细胞及卵泡的能力。为了阐述白消胺及环磷酰胺联合使用对小鼠卵巢中生殖干细胞的影响，我们通过免疫荧光及对阳性细胞技术的方法观察生殖干细胞的分布情况以及分析了不同实验组中生殖干细胞的数量变化。
[0045]总而言之，本发明的研究结果表明，人宫内膜干细胞的移植治疗有助于小鼠卵巢功能的恢复，这位日后临床中化疗药物引起卵巢早衰患者的治疗带来了新的希望。
[0046]月经血来源干细胞(人宫内膜干细胞)的发现为卵巢早衰的临床治疗带来了新的希望，经研究发现其具有向多种细胞分化的潜能，在移植入损伤的动物模型体内具有促进损伤组织修复的能力。其取材方便，增殖能力强，经培养可获取足够的供移植的细胞数量，且研究发现，经血中干细胞的含量是骨髓来源的30倍左右。该种细胞干细胞免疫源性低，无致瘤性，作为自体移植或供体移植都不失为一个再生医学新的种子细胞。因此，经血来源的干细胞(人宫内膜干细胞)具有促进卵巢功能修复的能力，即，具有治疗女性不孕不育的作用。
[0047]为了治疗卵巢早衰，促进卵巢功能的恢复，将人宫内膜干细胞进行常规的移植即可；移植方式可参照目前现有的骨髓干细胞的移植。
【附图说明】
[0048]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0049]图1为人宫内膜干细胞MP135的形态、表型及多潜能性分析图；
[0050](A)体外培养的MP135细胞具有间质细胞的形态；
[0051](B)转染 GFP 的 MP135 细胞；
[0052](C)染色体核型分析显示，第20代MP135细胞染色体核型正常；
[0053](D)流式细胞仪检测MP135细胞能够表达骨髓间充质干细胞特异性标记物；
[0054](E)在体外诱导分化条件下，流式细胞仪检测MP135能够分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞；Scale bars, 200 μπι (A, B) ο
[0055]图2为人宫内膜干细胞促进不孕小鼠体重及动情周期的恢复情况图；
[0056](A)在整个实验过程中，未处理组小鼠的体重明显下降，而细胞移植组小鼠的体重从第4周期开始逐渐恢复(P < 0.01)，但与正常对照组无明显差异(P > 0.05);
[0057](B)不同实验中小鼠动情前期，动情期，动情后期及动情间期占动情周期的百分比分析.从细胞移植后第4周开始，细胞移植组中小鼠的动情周期逐渐趋于正常对照组小鼠，而未处理组的小鼠则主要维持在动情间期.
[0058]图中，DE代表动情间期，ME代表动情后期，E代表动情期，PE代表动情前期。
[0059]图3是人宫内膜干细胞移植后第2，4，8周，不同实验组中小鼠动情周期阴道脱落细胞涂片观察结果。
[0060]如图所示:在细胞移植组的小鼠的阴道涂片结果中可观察到典型的角化上皮细胞(黑色箭头)及羊齿细胞(白色箭头)，而未经处理对照组动物则无明显变化。
[0061]图4是人宫内膜干细胞移植后不孕小鼠生育能力的恢复情况，通过评估不同实验组中小鼠连续交配的周期对其生育能力进行评价图；
[0062]A图为正常对照组、未处理组及人宫内膜干细胞移植组中小鼠的产仔情况；箭头为未处理组中的死胎；
[0063]B图为怀孕小鼠的平均产仔量(平均值土标准误差).每组动物η =
10.**Ρ〈0.001 ；
[0064]C图为交配实验结束后，卵巢切片苏木素及伊红染色(Η&Ε)结果，未治疗组卵巢表现为纤维化结构，无卵泡结构，人宫内膜干细胞移植组卵巢与正常组类似，有各级卵泡存在。Scale bars, 10um0
[0065]图5是人宫内膜干细胞在不孕小鼠体内的示踪分析:
[0066]A图是活体成像技术观察的鼠尾静脉注射带有GFP标记的人宫内膜干细胞在小鼠体内的分布情况；观察结果显示在细胞移植后的第6-12小时，GFP阳性细胞首先进入骨盆组织中；在第24小时逐渐迀移至胸腺组织中；而在移植后第48小时，GFP荧光信号逐渐变弱；在细胞移植后第7天，仅能在骨盆组织中检测到少量GFP阳性信号；
[0067]B图是人特异性核抗原(Hu)在小鼠的卵巢组织中的豆状卵泡上的表达情况，发现细胞移植后的2个月的卵巢组织中可观察到GFP与Hu双标记的阳性细胞；
[0068]C图为细胞移植后2个月，在卵巢组织中的窦状卵泡上可观察到GFP与FSHR双标记的阳性细胞.Scale bars: 100 μ m (B, C), 10 μ m (B, C insets) ο
[0069]图6是人宫内膜干细胞移植提高不孕小鼠卵巢生殖干细胞的增殖能力情况。
[0070]A图为在不同实验组中，BrdU与MVH双标的阳性细胞主要表达在小鼠卵巢的表皮组织中.Scale bars:50 μm ；insets, 10 μm ；
[0071]B图为不同实验组中小鼠卵巢生殖干细胞的计数结果分析显示，结果表明化疗减少了生殖干细胞数量，而人宫内膜干细胞移植促进了生殖干细胞的修复(均值土标准误差，每组动物η = 5)。
【具体实施方式】
[0072]实施例1、人宫内膜干细胞鉴定
[0073]细胞来源及培养
[0074]人宫内膜干细胞系ΜΡ135来源于40岁中国女性的月经血，ΜΡ135第3代细胞由浙江大学项春生教授提供，人类细胞的使用获得上海交通大学附属国际和平妇幼保健医院伦理委员会的批准。
[0075]ΜΡ135细胞在含有子宫内膜/月经的干细胞培养基中生长[13]，放置于含5%C0237°C培养箱中。细胞经胰蛋白酶消化，传代培养，当细胞融合率达到80-90%进行后续实验。
[0076]流式细胞术分析
[0077]利用流式细胞仪对MP135细胞表面特异性标记物⑶29、⑶90、⑶34、⑶45、⑶117、HLA-DR以及0CT4进行分析。具体如下:
[0078]将MP135细胞重悬(使浓度为I X 106cells/ml)在含有2 %牛血清白蛋白的PBS中，分别加入PE标记的小鼠抗人CD90、CD29及CD34抗体，FITC标记小鼠抗人CD45、0CT4抗体，使用FC500流式细胞仪及Coulter CXP软件进行分析。
[0079]人宫内膜干细胞的诱导分化
[0080]通过人骨髓间充质干细胞的功能鉴定试剂盒诱导人宫内膜干细胞分化。骨细胞和软骨细胞分别通过兔抗人骨钙蛋白多克隆抗体和兔抗人胶原蛋白II抗原多克隆抗体标记。冰冻切片的油红O染色为脂质染色。
[0081]结果如下:
[0082]人宫内膜干细胞(MP135)在体外生长迅速，形态学类似于成纤维样细胞(图1A-B)。染色体核型分析结果表明，传代第20代的细胞是二倍体细胞，没有染色体畸变的发生(图1C)。我们采用流式细胞术技术检测第5代MP135细胞的表型，结果显示，99.1%的细胞表现出⑶29阳性，99.4%细胞表现⑶90阳性，但并不表达⑶34和⑶45。人宫内膜干细胞不表达人类白细胞DR抗原。同时，18.9%细胞表达0CT4，10.9%细胞表达⑶117 (图1E)。此外，人宫内膜干细胞还具有多向分化潜能，可诱导分化为脂肪细胞、成软骨细胞及骨细胞等多种细胞。以上研究结果表明人宫内膜干细胞具有间充质干细胞的特性。
[0083]备注说明:图1为宫内膜干细胞形态学、表型和多能性。㈧和⑶体外培养的宫内膜干细胞具有间充质干细胞的特征；(C)染色体分析显示宫内膜干细胞体外传代20代后仍保持正常核型；(D)流式细胞分析宫内膜干细胞表达间充质干细胞表明标志物；(E)宫内膜干细胞在体外诱导分化脂肪、软骨和骨细胞。
[0084]实施例2、人宫内膜干细胞移植可促进小鼠体重和动情周期的恢复
[0085]动物实验
[0086]1.选取6周龄C57BL/6野生型雌性小鼠(60只)，通过腹腔注射白消安(30mg/kg)和环磷酰胺(120mg/kg)建立卵巢早衰动物模型；
[0087]2.同样选取年龄匹配雌性小鼠腹腔注射DMSO作为实验对照组(10只)；
[0088]3.在化疗药物注射后I周