N末端截短的胰岛素类似物的制作方法
【专利说明】N末端截短的胰岛素类似物
[0001] 有关联邦政府发起的研究或开发的声明 本发明用在美国国立卫生研究院于资助号DK40949和DK074176授予的合作协议下的 政府支持完成。美国政府可对本发明享有某些权利。
[0002] 发明背景 本发明涉及显示增强的药学性质（例如更快的药代动力学和/或对超过室温的热原纤 维形成的抗性增强）的多肽激素类似物。更具体地讲，本发明涉及通过残基B1-B3缺失与 A链或B链的其它修饰组合而修饰的胰岛素类似物。这类非标准序列可任选在胰岛素类似 物的A链或B链的其它部位含有标准氨基酸取代。
[0003] 截短的和/或非标准蛋白质（包括治疗剂和疫苗）的工程改造可具有广阔的医学 和社会效益。医学效益的实例会为蛋白质药代动力学性质的优化。更多的社会效益的实例 会为对于在其中电力和冷藏条件不能始终可得的的发展中世界的地区使用，就在室温下或 超过室温的降解而言，与标准蛋白质相比更耐受的蛋白质的工程改造。治疗性蛋白质的实 例通过胰岛素提供。就药代动力学或对热降解的抗性而言，含有非标准氨基酸取代的胰岛 素类似物原则上可显示更优的性质。在皮下注射后由胰岛素吸收的药代动力学提出的挑战 影响患者实现严格血糖控制的能力，并限制胰岛素栗的安全性和性能。糖尿病在非洲和亚 洲的普遍盛行加重了由其物理降解提出的挑战。这些问题常常关联，因为本领域已知的加 快在皮下注射后的吸收的修饰常常使用胰岛素对化学和/或物理降解的抗性变差。因为原 纤维形成提出超过室温的降解的主要途径，在这类受到挑战的区域，设计的抗原纤维形成 制剂可提高胰岛素替代疗法的安全性和功效。本发明涉及缺乏残基B1-B3的截短B链以及 A链或B链中的其它部位的标准或非标准取代修饰和提高胰岛素的不同性质的用途。在过 去十年内，已描述了对胰岛素分子的特定化学修饰，其选择性地修饰蛋白质的一个或另一 个特殊性质以利于目标应用。虽然在重组DNA时代（1980)开始时，对于在不同治疗环境中 的用途，野生型人胰岛素被设想为最优的，但是过年十年中胰岛素类似物的广泛临床应用 表明，各经设计以满足特殊的未被满足的需要的一系列类似物，会提供重大的医学和社会 效益。
[0004] 给予胰岛素早被证实为糖尿病的治疗法。胰岛素是一种小的球状蛋白质，其在脊 椎动物的代谢中起重要作用。胰岛素含有2条链，含有21个残基的A链，含有30个残基 的B链。该激素作为Zn2+稳定的六聚体贮存于胰β细胞内，但在血液中作为不含Zn2+的 单体起作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，所述胰岛素原中连接区（35个残基）将 B链的C末端残基（残基Β30)与A链的N末端残基连接起来（图1Α)。许多证据表明它由 胰岛素样核心和无序的连接肽组成（图1Β)。认为在粗面内质网（ER)中，3个特定二硫桥 (A6-A1UA7-B7和A20-B19 ;图IA和图1B)偶联成为氧化折叠的胰岛素原。在从ER输出至 高尔基体后不久，胰岛素原装配形成可溶性Zn2+配位的六聚体。内切蛋白酶消化并转化成 胰岛素发生于未成熟的分泌颗粒中，接着发生形态缩合。通过电子显微镜术（EM)形象化为 成熟贮藏粒内锌胰岛素六聚体的晶体排列。图IC以示意形式显示胰岛素的序列。通过氨 基酸身份（通常使用标准三字母代码）、链和序列位置（通常为上标）标示各个残基。
[0005] 发现在皮下注射后胰岛素吸收的药代动力学特征与胰岛素六聚体的解体速率相 关。虽然不希望本发明受理论限制，但是认为导致胰岛素六聚体加速解体的胰岛素分子的 修饰促进胰岛素单体和二聚体从皮下贮库更快地吸收进入血流。糖尿病患者的胰岛素替代 疗法的一个主要目的是严格控制血糖浓度以防止其在健康人类受试者的正常范围特征之 上或之下偏移。低于正常范围的偏移与即刻的肾上腺素能或神经低血糖症状（其在严重发 作时导致抽搐、昏迷和死亡）有关。高于正常范围的偏移与微血管疾病（包括视网膜病、失 明和肾衰竭）的长期风险增加有关。因为在皮下注射后野生型人胰岛素吸收的药代动力学 相对于餐后代谢稳态的生理要求常常太慢，且太持久，所以在过去20多年内花费了相当大 的努力以开发显示更快吸收的胰岛素类似物，其具有在开始时更快而在持续时间不太持久 的药效作用。这类本领域已知的速效类似物的实例是[LySB2S，Pr0 B29]-胰岛素（KP-胰岛素， Humalog? 的活性组分）、[AspB2S]_ 胰岛素（Novalog?)和[LysB3，GluB29]_ 胰岛素（Apidra?)。 虽然广泛用于临床实践，但是这些类似物显示两个主要限制。第一，虽然它们的药代动力学 和药效学分布型比野生型胰岛素的更快，但是它们在许多患者中不会快到足以使血糖控制 最优化或使得能够安全有效地使用基于算法的胰岛素栗（闭环系统）。第二，这些类似物 中的氨基酸取代损害胰岛素的热力学稳定性，并加剧其在高于室温时对原纤维形成的易感 性。因此，加快吸收和加快降解之间的交换限制了这些制品的安全性、功效和实际便利。
[0006] 较高的温度、较低的pH、振荡或脲、胍、乙醇助溶剂或疏水表面的存在增加原纤维 形成，其是在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的制备、储存和使用中的一个严重 的顾虑。现有的美国药物法规要求，如果原纤维形成以1%或更高的水平发生，则弃去胰岛 素。因为原纤维形成在较高的温度下增加，糖尿病患者最好必须在用前将胰岛素保持冷藏。 对于使用外部胰岛素栗（其中将少量的胰岛素或胰岛素类似物定期注射到患者体内）的这 类患者，胰岛素或胰岛素类似物的原纤维形成可为特别的顾虑。在这类用法中，胰岛素或 胰岛素类似物不在栗装置内保持冷藏，且胰岛素的原纤维形成可导致用于将胰岛素或胰岛 素类似物注射入身体的导管阻塞，可能导致不可预测的血糖水平波动或甚至危险的高血糖 症。至少一份近来的报告表明，赖脯胰岛素（KP-胰岛素，其中残基B28和B29相对于其在 野生型人胰岛素中的位置被互换的一种类似物；商品名Humalog?)可能对原纤维形成特别 敏感，并导致胰岛素栗导管堵塞。对于25°C以上的温度每KTC的递增，胰岛素显示降解速 率10倍或更高倍的提高；因此，准则要求在温度<30°C下并优选冷藏保存。
[0007] 蛋白质原纤维形成的本发明的理论假设，原纤维形成的机制通过部分折叠的中间 状态进行，所述中间状态进而聚集形成促淀粉状变核。在这个理论中，有可能的是，稳定天 然状态的氨基酸取代可或不可稳定部分折叠的中间状态，并且可或不可增加（或降低）在 天然状态和中间状态之间的自由能屏障。因此，所述当前理论表明，胰岛素分子中的指定氨 基酸取代增加或降低原纤维形成风险的趋势是高度不可预测的。
[0008] 在促淀粉状变核形成（amyloidogenic nucleus)中的最初步骤可包括暴露于天然 胰岛素表面或由于部分蛋白质解折叠而短暂暴露的非极性侧链之间的非天然疏水相互作 用。残基B1、B2和B3 (PheB1-ValB2-AsnB3)显示明显暴露于野生型胰岛素晶体结构中及在 其定位中实质的变化性（图2A)。在溶液中的工程改造的胰岛素单体的NMR研究中，残基 B1-B3也不十分有序，如通过1H-NMR谐振线宽度、13C-NMR化学位移和远程残基内核欧沃豪 斯效应（NOEs)的缺乏所表明（图2B)。尽管这些残基在哺乳动物胰岛素序列中的保守性， 但是合成类似物的研究显示，残基B1-B5可从B链中缺失而又不显著丧失与胰岛素受体的 结合，且不显著丧失生物活性。但是，野生型和突变型胰岛素原的折叠和分泌研究显示，残 基B1-B5单独和组合地促进内质网中二硫键配对的效率和保真度（Liu，M.，Hua，Q. X.， Hu, S. Q. , Jia, ff. , Yang, Y. , Saith, S. E. , Whittaker, J. , Arvan, P. & Weiss, M. A. (2010). Deciphering the hidden informational content of protein sequences: foldability of proinsulin hinges on a flexible arm that is dispensable in the mature hormone (解密蛋白质序列隐藏的信息内容：胰岛素原的折叠性取决于在成熟激素 中是非必需的柔性臂）.J； 〇￡皿285，30989-31001)。具体地说，发现在培养的人 细胞系中，在Bl位不同极性或带电荷的氨基酸取代损害胰岛素原的细胞折叠和分泌。残基 PheB1因此在折叠过程中可被视为"疏水锚"。B链的B1-B5臂代表胰β细胞内的关键折叠 元素。
[0009] 因此，需要这样的胰岛素类似物，其显示在高于室温时对原纤维形成的抗性提高， 同时保持快速六聚体解体且同时显示相应的野生型胰岛素的至少一部分活性并保持其化 学和/或物理稳定性的至少一部分。
[0010] 发明概述 因此，本发明的一个方面是提供这样的胰岛素类似物，其提供在高于室温时对原纤维 形成的抗性提高，同时保持快速的六聚体解体，因此在皮下注射后吸收加快。本发明克服 了之前速效胰岛素类似物的局限性，即它们比野生型胰岛素对原纤维形成更敏感。一旦 在制备过程中实现二硫键配对和蛋白质折叠，要求保护的本发明便利用残基Β1-Β3的非 必需性。通过胰蛋白酶对在野生型残基AsnB3位置的Β3位上含有Lys或Arg的前体的作 用，实现脱去残基B1-B3。所述前体的一个实例是类似物格鲁辛胰岛素，其是制品Apidra (Sanofi-Aventis)的活性组分。缺乏残基PheB1-ValB2-Asn B3的类似物因此含有缩短的B链 (27残基）。缩短的B链赋予在高于室温时对原纤维形成的抗性，同时能够天然样地结合胰 岛素受体。
[0011] 本发明的实质是通过N末端脱去残基B1-B3缩短B链保护蛋白质免于在 高于室温时的原纤维形成，并且可在含有残基PheB1、ValB2和B3位的Lys或Arg的 前体多肽有效折叠和二硫键配对以引入新的胰蛋白酶位点后实现。胰蛋白酶产物 脱-[B1-B3]-脱-B23-B30]-胰岛素类似物进而提供前体，用于在C末端B23-B30区段含 有一个或多个取代或非标准修饰的胰岛素类似物的胰蛋白酶介导的半合成；关键的是，胰 蛋白酶介导的半合成"修复"残基B23-B30的C末端缺失但不恢复B1-B3区段。该步骤 的顺序（即在胰蛋白酶消化前折叠）避开了通过在二硫键配对前脱去残基B1-B3而另引 入的折叠缺陷。起始