原料可以是含有B3位的Lys或Arg的成熟胰岛素类似物、含有B3位 的Lys或Arg和A8处的其它取代的胰岛素类似物、含有B3位的Lys或Arg的胰岛素原类 似物、含有B3位的Lys或Arg和A8处的其它取代的胰岛素原类似物或含有B3位的Lys 或Arg且其折叠后胰蛋白酶消化产生适于半合成以提供脱-[B1-B3]-胰岛素类似物的 脱-[B1-B3]-脱-B23-B30]-胰岛素类似物的相应的单链生物合成前体。
[0012] 总的说来，本发明提供胰岛素类似物，其包含缺乏残基B1-B3的缩短的B链多肽以 及A链或B链的一个或多个其它取代。除非另有说明，否则应了解氨基酸的位置是与野生 型胰岛素相比较的位置。因此例如在脱-[B1-B3]胰岛素类似物中，B链中的第7个氨基酸 仍会标明为位于BlO位。在一个实例中，缩短的B链多肽在B29位掺入鸟氨酸（Orn)、正亮 氨酸（Nle)或谷氨酸（Glu)。在另一个实施方案中，缩短的B链多肽含有B28位的赖氨酸 (Lys)和B29位的脯氨酸（Pro)。在另一个实施方案中，缩短的B链多肽含有B28位的天冬 氨酸（Asp)和B29位的Nle或Orn。在又一个实施方案中，胰岛素类似物是哺乳动物胰岛 素类似物，例如人胰岛素的类似物。在一组具体的实施方案中，在胰蛋白酶处理前，B链多 肽包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列及其具有3个或更少个其它氨基酸取代的多肽。在另 一组具体的实施方案中，在用胰蛋白酶消化和半合成后，所得多肽可包含选自SEQ ID NO: 5-7的序列。在又一组具体实施方案中，指定的单链胰岛素类似物，B链多肽是包含SEQ ID NO: 9提供的氨基酸序列、长度为51-86的单一延长的多肽的一部分及其具有3个或更少个 其它氨基酸取代的多肽。
[0013] 另外或备选地，胰岛素类似物在B链的24位可含有非标准氨基酸取代。在一个 具体实例中，B24处的非标准氨基酸是环己烷基丙氨酸（Cha)。在另一个具体实例中，B24 处的非标准氨基酸含有卤化芳环，例如五氟-Phe、2-F-Phe、2-Cl-Phe、2-Br-Phe、4-F-Phe、 4-Cl-Phe或4-Br-Phe，其中"2"指明Phe芳环邻位上的单个卤素取代，且其中"4"指明Phe 芳环的对位。另外或备选地，胰岛素类似物可含有A8位的氨基酸取代，籍此野生型胰岛素 (ThrAS)中的β-支链侧链被非-β-支链极性或带电荷的侧链（例如Arg、Gln、Glu、HisS Lys)取代。
[0014] 还提供编码包含在B24位或B29位或两个位置中掺入非标准氨基酸的B链多肽的 胰岛素类似物的核酸。在一个实例中，非标准氨基酸由终止密码子（例如核酸序列TAG)编 码。表达载体可包含所述核酸，宿主细胞可含有所述表达载体。
[0015] 还提供编码包含在A3位掺入的赖氨酸（Lys)或精氨酸（Arg)取代和任选其它取 代（例如产生B29位的谷氨酸的取代或A8位的Thr以外的氨基酸的取代）的A链多肽的 胰岛素类似物的核酸。表达载体可包含所述核酸，宿主细胞可含有所述表达载体。
[0016] 本发明还提供治疗患者的方法。所述方法包括给予患者生理有效量的胰岛素类似 物或其生理上可接受的盐，其中胰岛素类似物或其生理上可接受的盐含有缺乏残基B1-B3 的缩短的B链多肽以及上述B24、B28、B29或A8位置处的一个或多个其它取代。在一个实 施方案中，给予患者的胰岛素类似物的缩短的B链含有B29位的Glu。在再一个实施方案 中，胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物，例如人胰岛素的类似物。在一组具体的实施方 案中，B链多肽包含选自SEQ ID NO: 5-7及其具有3个或更少个其它氨基酸取代的多肽的 氨基酸序列。
[0017] 若干附图简述 图IA是包括A链和B链以及显示具有邻接二元切割位点（实心圆）和C肽（空心圆） 的连接区的人胰岛素原序列（SEQ ID NO: 1)的图示。
[0018] 图IB是由胰岛素样部分和无序连接肽（虚线）组成的胰岛素原的结构模型。
[0019] 图IC是人胰岛素序列（SEQ ID NO: 2和3)的图示，其标出残基B24在B链中的 位置。
[0020] 图2A和2B提供显示胰岛素 B链N末端臂的可能的构象变化的分子模型。残基 B1-B6以晶体学T态原体（图2A)和NMR推导的溶液结构的系综（图2B)显示。在每种情 况下臂表示为一个代表性结构的空间填充模型下的棍。图2A的右上方显示了灰度代码。图 2A 的结构获自 PDB 存放 4INS、1APH、1BPH、1CPH、1DPH、1G7A、1TRZ、1TYL、ITYM 和 IZNI ;图 2B 中结构获自PDB存放ITYL和1G7A。
[0021] 图3是显示胰岛素类似物受体结合研究的结果的一对图。在图2A中，对胰岛素 受体（IR-B)的B同种型的相对活性通过竞争结合测定而确定，其中通过增加人胰岛素 ()或其以下类似物的浓度置换受体结合的125I标记的人胰岛素：0rnB29-胰岛素（▲)和 脱-[Bl-B3]-0rnB29_胰岛素（▼)。在图2B中，对I型IGF受体（IGF-IR)的相对活性通过 竞争结合测定而确定，其中通过增加人胰岛素（)或其以下类似物的浓度置换受体结合 的 125I 标记的 IGF-I :0rnB29_ 膜岛素（▲)和脱-[Bl_B3]-〇rnB29-膜岛素（▼)。
[0022] 图4是显示脱-[B1-B3] Apidra?胰岛素（GIub29; )与全长Apidra?胰岛素 (LysB3, GIub29) (?)的剂量反应的图。该图显示给药后第1小时内血糖水平降低速率对比 纳摩尔/300 g大鼠的胰岛素的剂量。
[0023] 发明详述 本发明涉及提供在高于室温时对原纤维形成有抗性的胰岛素类似物，其中类似物保持 快速的六聚体解体，且其中类似物那么保持相应的未修饰的胰岛素或胰岛素类似物的生物 活性的至少一部分。
[0024] 本发明涉及在前体分子折叠和二硫键配对后脱去残基B1-B3以在原纤维形成开 始前的滞后时间方面改进胰岛素类似物的性质。在一个实例中，脱去残基B1-B3与B23-B30 区段和特别是与B24、B28和/或B29位的一个或多个氨基酸取代或修饰的组合。
[0025] 在一个实施方案中，本发明提供胰岛素类似物，其通过B24位的苯丙氨酸被非标 准氨基酸（例如环己烷基丙氨酸（Cha))或在芳环4位含有卤素原子（F、Cl或Br)的苯丙 氨酸的衍生物取代提供更快的六聚体解体。在另一个具体的实施方案中，脱-[B1-B3]类似 物通过PheB24被在芳环2位含有卤素原子（F、Cl或Br)的衍生物取代，有关热力学稳定性 提高。在又一个实施方案中，脱-[B1-B3]类似物含有B28和/或B29位的取代以赋予更快 解体速率的六聚体；本领域已知的实例是Aspb28 (如在Novolog?中）、Lys B2S-ProB29 (如在 Humalog?中）和GIub29 (如在Apidra?中）。因此，本发明提供这些类似物的脱-[B1-B3]形 式。然而，本发明不限于人胰岛素及其类似物。还设想这些取代也可在动物胰岛素中进行， 以非限制性实例为例，例如猪、牛、马和犬胰岛素。另外或备选地，本发明的胰岛素类似物可 在B链的29位含有非标准氨基酸取代，其在野生型胰岛素中为赖氨酸（Lys)。在一个具体 的实例中，B29位的非标准氨基酸是鸟氨酸（Orn) ;B29位的非标准氨基酸还可以是正亮氨 酸（Nle)。脱去残基B1-B3也可与A链8位的非β -支链侧链取代组合，单独或与B24、B28 或B29的上述修饰组合。
[0026] 还发现脱-[Bl-B3]-0rnB29-胰岛素赋予相对于野生型胰岛素或0rn B29_胰岛素免 于原纤维形成的保护而不损害与胰岛素受体的结合。
[0027] 此外，鉴于人与动物胰岛素之间的相似性，以及以往动物胰岛素在人糖尿病患者 中的使用，还预期可将胰岛素的序列中的其它微小修饰引入，尤其是被视为"保守"的那些 取代。例如，氨基酸的其它取代可在具有类似侧链的氨基酸类型中进行而不偏离本发明。这 些氨基酸类型包括中性疏水氨基酸：丙氨酸（Ala或A)、缬氨酸（Val或V)、亮氨酸（Leu或 U、异亮氨酸（lie或I)、脯氨酸（Pro或P)、色氨酸（Trp或W)、苯丙氨酸（Phe或F)和甲硫 氨酸（Met或M)。同样，中性极性氨基酸可在其类型中彼此取代：甘氨酸（Gly或G)、丝氨酸 (Ser或S)、苏氨酸（Thr或T)、酪氨酸（Tyr或Y)、半胱氨酸（Cys或C)、谷氨酰胺（Glu或 Q)和天冬酰胺（Asn或N)。碱性氨基酸被认为包括赖氨酸（Lys或K)、精氨酸（Arg或R)和 组氨酸（His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸（Asp或D)和谷氨酸（Glu或E)。除非另有说 明或从上下文中显而易见，否则本文所述氨基酸应视为L-氨基酸。标准氨基酸还可被属于 相同化学类别的非标准氨基酸取代。以非限制性实例为例，碱性侧链Lys可被较短侧链长 度的碱性氨基酸（鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸）置换。Lys还可被中性脂族等排物正 亮氨酸（Nle)置换，所述中性脂族等排物正亮氨酸进而可被含有较短的脂族侧链的类似物 (氨基丁酸或氨基丙酸）取代。
[0028] 在一个实例中，除本发明的残基B1-B3脱去以外，本发明的胰岛素类似物还含有3 个或更少个保守取代。
[0029] 如本说明书和随附权利要求书所使用的一样，胰岛素或胰岛素类似物中的不同氨 基酸可用所讨论的氨基酸残基接着氨基酸的位置（任选用上标）表示。所讨论的氨基酸的 位置包括取代位于其中的胰岛素的A链或B链。因此，PheB1表示作为野生型胰岛素 B链上 第1个氨基酸的苯丙氨酸；ValB2表示野生型胰岛素 B链的第2个氨基酸等等，直到C末端 位置的ThrB3°。在脱去残基B1-B3 (命名为脱-[B1-B3])时，保持这种编号，使得GIub4将是 脱-[B1-B3] B链的第1个氨基酸，PheB24是脱-[B1-B3] B链的第21个氨基酸等。
[0030] 虽然不希望受理论的限制，但是本发明预期残基B1-B3限定了在促淀粉状变核的 形成机制中参与非天然分子间相互作用的非极性臂，因此它的脱去延迟或防止在高于室温 时原纤维形成的开始。野生型B3残基（Gln)被碱性侧链（Lys或Arg)取代赋予前体胰岛素 类似物B链或前体单链多肽的B结构域新的胰蛋白酶位点。因为本发明规定残基B1-B3的 胰蛋白酶去除只发生在