软骨结合型融合蛋白的制作方法
【专利说明】软骨结合型融合蛋白
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月29日提交的美国临时申请61/806, 599的优先权，该美国 临时申请以引用的方式整体并入本文。
【背景技术】
[0003] 创伤性关节损伤（例如韧带、肌腱以及软骨的撕裂）引发关节组织内的多因子变 性级联，包括抑制组织修复、上调细胞外基质分解代谢、细胞死亡以及关节变性的慢性周 期。虽然关节损伤的一些方面可以通过手术组织移植程序来修复，但这些方法可能仅部分 地恢复了关节的生物力学稳定性。包括手术疗法和姑息疗法在内的当前的治疗方法不足以 阻止关节运动的永久性改变。这种改变影响了物理力和细胞或组织力学变化的效应（即力 学生物学效应），包括细胞信号转导的改变，这促成了关节病理生理机制。不存在保护关节 组织防止由这些力学生物学效应所引起的改变的细胞信号转导的后果的现有药物疗法。因 此，产生关节变性病的风险在对关节造成创伤性损伤之后的数年内显著增加。
[0004] 根据⑶C，在2003年，关节炎和其它风湿性病况花费了美国1278亿美元（808亿美 元是医疗护理支出以及470亿美元是损失的收入）或1. 2%的国内生产总值。由创伤性关 节损伤所引起的关节变性病占关节炎的总负担的超过10%。因此，对由创伤性关节损伤所 引起的关节变性病的有效治疗的需要显著未得到满足。以下公开内容解决了这种需要并且 提供了其它益处。
【发明内容】
[0005] 以提供可接受的和有效的疗法的方式将药物直接递送到患病或受损伤的关节仍 是一项显著的挑战，如由近期出版物中的以下语句所说明：
[0006] "关节内疗法是具有挑战性的，这是因为所注射的物质从关节间隙中被快速排出； 这样的消除对于小分子和大分子这两者来说都是如此，所述小分子经由滑膜毛细血管离 开，所述大分子由淋巴系统清除。一般来说，可溶性物质具有仅以小时来度量的关节内停留 时间。"
[0007] (Evans 等，Nat. Rev. Rheumatol. 2014 年 1 月；10 (1) : 11-22)
[0008] 对应对这一挑战存在长期的和没有得到满足的需求是由在差不多八年前出版的 另一篇报道中所突出的相同问题来说明的：
[0009] "在未来的IA[关节内]治疗中应当作为目标的主要改进是更长的作用持续时间， 这是因为由于与施用相关的不适/疼痛以及可能的感染风险而期望限制每年IA注射的次 数。"
[0010] (Gerwin 等，Adv. Drug Deliv. Rev. 2006 年 5 月 20 日；58 (2) : 226-42)
[0011] 因此，本文提供了可以被直接递送到患病或受损伤的以提供可接受的和有效的疗 法的药物活性蛋白质。这些药物活性蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含与生长因子受 体（例如IGF-I受体）的细胞外域特异性结合的第一结构域和与软骨基质组分（例如硫酸 化糖胺聚糖和胶原）特异性结合的第二结构域；以及包含这些融合蛋白的药物组合物。这 些融合蛋白和药物组合物特别可用于治疗关节变性病，如骨关节炎。还提供了使用本文所 公开的融合蛋白和药物组合物来治疗肌肉骨骼疾病的方法。
[0012] 在一个方面，本公开提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一结合结构域和 第二结合结构域，其中所述第一结构域与生长因子受体的细胞外域特异性结合，并且所述 第二结构域与软骨基质组分特异性结合，并且在所述融合蛋白内（即在存在于所述融合蛋 白中时），每一个结合结构域均表现出特异性结合活性。
[0013] 在某些实施方案中，所述融合蛋白包含单条多肽链。在某些实施方案中，在所述融 合蛋白内（即在存在于所述融合蛋白中时），每一个结合结构域均表现出原生结合活性。
[0014] 在某些实施方案中，所述第一结构域是IGF-I受体结合结构域。在某些实施方案 中，所述IGF-I受体结合结构域具有包含人类IGF-I的氨基酸序列。在某些实施方案中，所 述IGF-I受体结合结构域具有包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
[0015] 在某些实施方案中，所述第二结构域是SGAG (硫酸化糖胺聚糖）结合结构域。在 某些实施方案中，所述sGAG结合结构域具有以下各项的sGAG结合结构域的序列、或与以下 各项的sGAG结合结构域同源或基本上同源的序列：富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸 重复蛋白(proline-arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP)、软骨粘 合素（CHAD)、抑瘤素 M、胶原 IX、BMP-4、纤维连接蛋白、RAND1、RAND2、RAND3、RAND4、RAND5、 RAND6、AKK15、RLR22、R1Q17、SEK20、ARK24、AKK24、AL1、AL2、AL3、LGT25、P印 184、P印 186、 P印185、P印239、P印246、ATIII、或FibBeta。在某些实施方案中，所述sGAG结合结构域包 含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID N0:2-13和54-70(参见表1)。在一个 具体的实施方案中，所述sGAG结合结构域包含SEQ ID N0:2。在一个具体的实施方案中，所 述sGAG结合结构域由SEQ ID NO:2组成。
[0016] 在某些实施方案中，所述第二结构域是胶原结合结构域。在某些实施方案中，所述 胶原结合结构域具有以下各项的胶原结合结构域的序列、或与以下各项的胶原结合结构域 的序列同源或基本上同源的序列：胞外基质蛋白、软骨寡聚基质蛋白、PRELP、软骨粘合素、 纤维调节素、核心蛋白聚糖或无孢蛋白。在某些实施方案中，所述胶原结合结构域包含选自 由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO: 14-16和21-27(参见表2)。
[0017] 在某些实施方案中，所述融合蛋白包含选自SEQ ID N0:17-20、28-53以及71-87 的氨基酸序列（参见表3)。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 18中 所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白由SEQ ID NO: 18中所示的氨 基酸序列组成。
[0018] 在某些实施方案中，在存在于所述融合蛋白中时，每一个结合结构域均表现出原 生结合活性。
[0019] 在某些实施方案中，所述融合蛋白包含少于40, 000个、35, 000个、30, 000个、 25, 000 个、20, 000 个、15, 000 个、10, 000 个、7, 500 个、5, 000 个、2, 500 个、1，000 个、500 个、 或250个氨基酸。
[0020] 在某些实施方案中，在注射到哺乳动物的关节的关节内间隙中之后，所述融合蛋 白在关节的软骨组织内保留如下的一段时间，这段时间是与所述融合蛋白的不同之处仅在 于第二结合结构域是不与软骨基质组分特异性结合的突变结构域的融合突变蛋白保留的 时间的至少：1. 5倍、2倍、3倍、四倍、五倍、六倍、七倍、Λ倍、九倍、十倍、二十倍、四十倍、 五十倍、六十倍、七十倍、八十倍、九十倍、或一百倍。在某些实施方案中，所述关节是受损 的关节或患病的关节，并且在软骨组织中保留的融合蛋白的量是每克组织至少约5pmol、约 lOpmol、约20pmol、或约50pmol。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节 是受损的关节或患病的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时， 当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的以下1)、2)、3)或4)的丢失相比时，所述关 节表现出以下各项的丢失减少：1)来自软骨组织的sGAG、2)细胞含量、3)总软骨组织、或 4)骨质量。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节或患病的 关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组织的特征在于 当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的产生相比时，所述软骨 组织中sGAG的产生增加。在某些实施方案中，所述哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损 的关节或患病的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天时，软骨组 织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的水平相比 时，所述软骨组织中sGAG的水平升高。
[0021] 在某些实施方案中，在将所述融合蛋白注射到哺乳动物的关节的关节内间隙中之 后，所述融合蛋白在所述关节的软骨组织内保留至少8天、至少9天或至少10天的时间。在 某些实施方案中，所述关节是受损的关节，并且在软骨组织中保留的融合蛋白的量是每克 组织至少约5pmol、约lOpmol、约20pmol、或约50pmol。在某些实施方案中，所述哺乳动物 是大鼠或马，所述关节是患病的关节或受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、 12天、13天、或14天时，当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组织中sGAG的 丢失相比时，所述关节表现出来自软骨组织的sGAG的丢失减少。在某些实施方案中，所述 哺乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、 13天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨 组织中sGAG的产生相比时，所述软骨组织中sGAG的产生增加。在某些实施方案中，所述哺 乳动物是大鼠或马，所述关节是受损的关节，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13 天、或14天时，软骨组织的特征在于当与已经被注射了对照蛋白的匹配对照关节的软骨组 织中sGAG的水平相比时，所述软骨组织中sGAG的水平升高。
[0022] 在另一个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文所公开的一种或 多种融合蛋白和糖皮质激素。合适的糖皮质激素包括而不限于阿氯米松（alclometasone)、 倍氯米松（beclometasone)、倍他米松（betamethasone)、布地奈德（budesonide)、 氯泼尼松（chloroprednisone)、环索奈德（ciclesonide)、皮质醇（cortisol)、可的 松普林（cortisporin)、可的伐唑（cortivazol)、地夫可特（deflazacort)、地塞米 松（dexamethasone)、氣氢缩松（fludroxycortide)、氣尼缩松（flunisolide)、醋酸 氣轻松（fluocinonide)、氣可龙（fluocortolone)、氣米龙（fluorometholone)、氣 替卡松（fluticasone)、己酸丙酬氛可他酯（hexacetonhydrocortamate)、氛化可的 松（hydrocortisone)、甲泼尼松（meprednisone)、甲泼尼龙（methylprednisolone)、 莫米松（mometasone)、帕拉米松（paramethasone)、泼尼松龙（prednisolone)、泼尼 松（prednisone)、泼尼立定（prednylidene)、孕留二稀（pregnadiene)、孕留三稀 (pregnatriene)、孕留稀（pregnene)、普洛托迪（proctosedyl)、利美索龙（rimexolone)、 四氢皮质酮（tetrahydrocorticosterone)、曲安西龙（triamcinolone)和乌倍他索 (ulobetasol)以及其药学上可接受的盐、水合物和酯。在某些实施方案中，所述糖皮质激素 以每克组合物1 μ g-l〇〇〇 μ g的浓度存在。在某些实施方案中，所述糖皮质激素与脂肪酸缀 合并且所述与脂肪酸的缀合任选地是经由酯键。在某些实施方案中，所述脂肪酸包含棕榈 酸。
[0023] 在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在微粒载体中。在某些实施方案中，所 述微粒载体是脂质体。在某些实施方案中，所述微粒载体是多层囊泡。在某些实施方案中， 所述微粒载体包含高熔融温度脂质。在某些实施方案中，所述脂质包含二硬脂酰基磷脂酰 胆碱（DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC)或氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC)。在某些实施 方案中，所述糖皮质激素以微粒载体脂质的〇. 1摩尔％ -20摩尔％的浓度存在于微粒载体 中。
[0024] 在某些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列的融合蛋白和地塞米松21-棕榈酸酯，其中所述地塞米松21-棕 榈酸酯被包含在含有HSPC的多层囊泡中。
[0025] 在某些实施方案中，在将本文所公开的融合蛋白/糖皮质激素组合物注射到受损 的关节或患病的关节的关节内间隙中之后，获得软骨基质合成读数或软骨降解读数，并且 所述读数相对于在不含糖皮质激素的匹配组合物的匹配注射之后所获得的对照读数显示 出改善作用。
[0026] 在另一个方面，本公开提供了一种治疗关节损伤或关节疾病的方法，所述方法包 括向关节的关节内间隙中施用治疗有效量的本文所公开的融合蛋白或组合物。在某些实施 方案中，所述关节损伤或关节疾病选自骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨降解、急性炎症性 关节炎、感染性关节炎、骨质疏松症、药物毒性相关的软骨缺损、或创伤性软骨损伤。
[0027] 在另一个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物在生物相容性水凝胶中包 含本文所公开的一种或多种融合蛋白。
[0028] 在某些实施方案中，所述水凝胶包含透明质酸（HA)、HA衍生物、纤维素衍生物、以 及肝素样结构域聚合物中的一种或多种。
[0029] 在某些实施方案中，所述水凝胶包含甲基纤维素。可以利用任何分子量的甲基纤 维素，例如约5kDa至约500kDa。可以在水凝胶中利用任何量的甲基纤维素。在某些实施方 案中，甲基纤维素的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。
[0030] 在某些实施方案中，所述水凝胶包含HA(例如透明质酸钠）。可以利用任何分子量 的HA，例如约IOkDa至约1.8MDa。可以在水凝胶中利用任何量的HA。在某些实施方案中， HA的量是水凝胶的约1重量％至约10重量％。
[0031] 在某些实施方案中，所述水凝胶包含肝素样结构域聚合物，所述肝素样结构域聚 合物包含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、或肝素。可以在水凝胶中利用任何量的肝素样结构域 聚合物。在某些实施方案中，肝素样结构域聚合物的量是水凝胶的约〇. 05重量％至2重 量％。
[0032] 在某些实施方案中，所述水凝胶在高于一定的温度（例如高于35°C )时具有热固 性。在某些实施方案中，所述水凝胶在低于一定的温度（例如低于35°C)时是流体或具有 剪切致稀性。
[0033] 在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约Iyg至约 1000 yg的浓度存在。在某些实施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公开的水凝胶约 100 μ g至约10, 000 μ g的浓度存在。
[0034] 在某些实施方案中，所述水凝胶还包含糖皮质激素。合适的糖皮质激素包括而不 限于阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、环索奈德、皮质醇、可的松普林、 可的伐唑、地夫可特、地塞米松、氟氢缩松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟可龙、氟米龙、氟替卡 松、己酸丙酮氢可他酯、氢化可的松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、帕拉米松、泼尼松龙、泼 尼松、泼尼立定、孕留二烯、孕留三烯、孕留烯、普洛托迪、利美索龙、四氢皮质酮、曲安西龙 和乌倍他索以及其药学上可接受的盐、水合物和酯。还可以利用修饰的糖皮质激素。在某 些实施方案中，所述糖皮质激素与脂肪酸（例如棕榈酸）经由酯键缀合。在某些实施方案 中，所述糖皮质激素被包含在微粒载体中，如脂质体或多层囊泡。脂质体微粒可以包含高熔 融温度（Tni)脂质，例如DSPC (二硬脂酰基磷脂酰胆碱）、DPPC (二棕榈酰基磷脂酰胆碱）或 HSPC (氢化大豆磷脂酰胆碱）。在某些实施方案中，所述糖皮质激素被包含在脂质体微粒中 并且以所述脂质体脂质的0. 1摩尔％ -20摩尔％存在。在某些实施方案中，糖皮质激素被包 含在脂质体微粒中并且所述脂质体脂质占所述水凝胶的〇. 01重量％ -10重量％。在某些 实施方案中，所述糖皮质激素以足够的浓度存在于水凝胶中，所述浓度足以在将所述药物 组合物（例如水凝胶）注射到关节中时，刺激软骨基质合成或刺激细胞存活或防止软骨基 质降解或防止细胞死亡。在某些实施方案中，所述糖皮质激素以每克水凝胶1 μ g-ιοοο μ g 的浓度存在。
[0035] 在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述关节 的软骨基质合成或降解读数相对于在单独注射融合蛋白或融合蛋白加上糖皮质激素的组 合之后的读数显示出改善作用。
[0036] 在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述糖皮 质激素以至少约8天（例如9天、10天、11天或12天）的半衰期存在于所述关节中。
[0037] 在某些实施方案中，在将所述组合物注射到关节的关节内间隙中之后，所述融合 蛋白在所述关节的关节内间隙中保留的时间比在单独注射时融合蛋白或糖皮质激素保留 的时间要长。
[0038] 在另一个方面，本公开提供了一种治疗肌肉骨骼疾病的方法，所述方法包括向关 节的关节内间隙中施用治疗有效量的本文所公开的一种或多种融合蛋白。在某些实施方案 中，所述肌肉骨骼疾病包括骨关节炎、类风湿性关节炎、损伤后软骨降解、急性炎症性关节 炎、感染性关节炎、骨质疏松症、或是药物毒性的结果。
【附图说明】
[0039] 图1描绘了本文所公开的融合蛋白与（A)硫酸乙酰肝素和（B)硫酸软骨素结合的 图表，这些图表示出了 GF-Fus3 (SEQ ID: 18)与乙酰肝素和硫酸软骨素结合，而GF-FusI (SEQ ID:1)或GF-Fus4(SEQ ID:33)则不与乙酰肝素和硫酸软骨素结合。
[0040] 图2描绘了本文所公开的融合蛋白与胶原结合的图表，所述图表示出了 GF-Fus5(SEQ ID:34)比 GF-Fus6(SEQ ID:35)更大程度地与胶原结合。
[0041] 图3描绘了两个图表，这两个图表示出了 GF-Fusl、GF-Fus2(SEQ ID:32)、 GF-Fus3、GF-Fus4、GF-Fus5、GF-Fus6融合蛋白和野生型IGF对牛软骨细胞（A)和BXPC-3 细胞（B)中AKT磷酸化的刺激，证实了所有融合蛋白均将pAKT上调到与由野生型IGF所引 起的上调相当的水平。数据是平均值土SEM。
[0042] 图4描绘了 sGAG丢失随时间（天）变化的图表，该图表示出了 GF-Fusl、GF-Fus2 和GF-Fus3以及野生型IGF减少了来自牛软骨外植体的sGAG丢失。数据是平均值土 SEM。
[0043] 图5描绘了 35S-硫酸盐向牛软骨外植体中的掺入的两个图表，这两个图表示出了 相比于疾病对照，通过连续添加 GF-Fusl、GF-FuS2、GF-Fus3以及野生型IGF (黑色条柱）获 得了增加。在从培养基中去除之后4天或8天时（白色条柱），GF-Fus3刺激了蛋白多糖生 物合成的最大程度的增加。在第8天（图5A)和第12天（图5B)结束的培养的最后48小 时期间测量35S-硫酸盐的掺入。数据是平均值土 SEM。无处理对照（健康）的35S-硫酸盐 掺入率在第8天和第12天时分别是132. 2±3. 6和140. 3±11.0(平均值土SEM)pmol/hr/ μ g DNA0
[0044] 图6是sGAG丢失％随时间（天）变化的图表，该图表示出了 GF-Fusl、GF-Fus3、 GF-Fus5以及GF-Fus6当在每一次更换培养基时供给这些融合蛋白时减少了来自牛软骨外 植体的sGAG丢失％。数据是平均值土 SEM。
[0045] 图7是sGAG丢失％随时间（天）变化的图表，该图表示出了当仅在第0天-第4 天向培养基中添加时，与GF-Fusl相比，GF-Fus3使来自牛软骨外植体的sGAG丢失％更大 程度地减少。数据是平均值土 SEM。
[0046] 图8呈现了 35S-硫酸盐向牛软骨外植体中的掺入的两个图表，这两个图表示出 了相比于疾病对照，当在每一次更换培养基时添加时GF-Fusl、GF-Fus3、GF-Fus5以及 GF-Fus6使这种掺入增加。GF-Fus3在仅在第0天-第4天添加时刺激了 35S-硫酸盐掺入 的最大程度的增加。在第8天（图8A)和第12天（图8B)结束的培养的最后48小时期间 测量35S-硫酸盐的掺入。数据是平均值土 SEM。无处理对照（健康）的35S-硫酸盐掺入率 在第8天和第12天时分别是0. 117±0. 0099和0. 083±0. 0047(平均值土SEM)nmol/hr/ μ g DNA0
[0047] 图9 : (A)是接受GF-Fus3和抗Infl-I (地塞米松）单独处理和组合处理的牛外 植体的sGAG丢失％随时间（天）变化的图表并且（B)是所述牛外植体的35S-硫酸盐掺入 随时间（天）变化的图表。相比于疾病对照，使用GF-Fus3与抗Infl-2 (地塞米松-21-棕 榈酸酯）的组合获得了最大程度的sGAG丢失％减少和35S-硫酸盐掺入增加。在第8天和 第12天（图9B)结束的培养的最后48小时期间测量35S-硫酸盐的掺入。数据是平均值 土SEM。无处理对照（健康）的35S-硫酸盐掺入率在第8天和第12天时分别是153. 5±9. 1 和123·2±8·8(平均值±SEM)pmol/hr/μgDNA。
[0048] 图10呈现了以下的图表：㈧GF-Fus2从凝胶4中的累积释放；(B) GF-Fus2从凝胶 3中的累积释放；(C)GF-Fus2从凝胶4中的每个时间点的释放；(D)GF-Fus2从凝胶3中的 每个时间点的释放；(E)野生型IGF从凝胶4中的累积释放；(F)野生型IGF从凝胶3中的 累积释放；(G)野生型IGF从凝胶4中的每个时间点的释放；(H)野生型IGF从凝胶3中的 每个时间点的释放。GF-Fus2和野生型IGF在第0天-第3天从凝胶3和凝胶4这两者中 以相似的速率释放，而在第4天之后没有进一步释放。数据是平均值土 SEM。
[0049] 图11A、B以及C是抗Infl-2 (地塞米松-21-棕榈酸酯）从本文所公开的使用命 名规则凝胶X-Y的水凝胶制剂中的累积释放随时间（天）变化的图表，其中X对于凝胶1和 凝胶2来说分别是1或2,并且Y是1-5以指示纳米粒子类型。抗Inf 1-2的释放速率是不 同的以使得在第9天时最快的释放制剂（凝胶2-3)与最慢的释放制剂（凝胶1-1和1-3) 之间的累积释放相差4倍。数据是平均值土SEM。
[0050] 图12呈现了来自以下各项的sGAG丢失％的图表：㈧人类