增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法

增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
【专利说明】增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/790, 301的优 先权，该临时专利申请的全部内容在此通过引用并入此处。
[0003] 序列表
[0004] 本申请是电子提交的，并且包含电子提交的txt格式的序列表。该txt文件包含 题目为"2014-03-14_5658-00203_ST25. txt"的序列表，其创建于2014年3月14日，大小 是31093字节。这个txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，因此通过引用其全部并 入此处。
[0005] 引言
[0006] 细菌感染仍然给人类以及农业和家养动物造成显著的健康危害。抗生素抗性的 增长提高了对在农业中避免使用抗生素的需要，以及开发替代方法来控制细菌感染和人类 食品供应的细菌污染的需要。沙门氏菌属（Salmonella)和大肠杆菌（E.coli)通常被报 道是世界范围内人类食物传播的感染的细菌原因，流行病学证据表明包括家禽和家禽产品 在内的肉制品是人类感染的主要来源。在美国，每年报告估计一百四十万例的人类沙门氏 菌病。在这些病例中，虽然有一些其它血清变种也显示在人类中导致肠炎，但最常分离的 是肠炎沙门氏菌血清变种（S.enterica serovars Enteritidis) (SE)和鼠伤寒沙门氏菌 (Typhimurium) (ST)。和重大感染率有关的其它革兰氏阴性细菌包括志贺氏菌属（Shigella spp)、弧菌属（Vibrio spp)、欧文氏菌属（Erwinia spp)、克雷伯菌属（Kebsiella spp)、 枸橡酸杆菌属（Citrobacter spp)、耶尔森氏菌属（Yersinia spp)、普罗维登斯菌属 (Providencia spp)及类似细菌。需要控制这些细菌感染的新方式。

【发明内容】

[0007] 公开了一种疫苗载体，其包含编码PAL多肽的第一多核苷酸序列。PAL多肽是疫苗 载体中异源的、非天然表达的重组多肽。PAL多肽选自：SEQ ID NO :1、和SEQ ID NO :1具有 90%同一性的序列，比如SEQ ID NO :6、或其至少6个氨基酸长的免疫原性片段。多肽可表 达在疫苗载体的表面上。SEQ ID NO :1的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4、SEQID NO :5、SEQ ID NO :36 或 SEQ ID NO :37。疫苗载体还可以包含编码 免疫刺激多肽的第二多肽序列。免疫刺激多肽也可以表达在疫苗载体的表面上。免疫刺激 多肽可以是能够与⑶40结合的⑶154多肽或HMGBl多肽。⑶154多肽包含少于50个氨基 酸，并且包含氨基酸140-149或其同源物。
[0008] 根据本发明的疫苗可以包含在载体内，载体如病毒、酵母、细菌、或脂质体。一方 面，所述疫苗包含多核苷酸，其编码SEQ ID NO :42、44或46的多肽，或者和这些序列之一具 有90 %同一性的序列。药物组合物可以由此处所述的疫苗载体和药学上可接受的载体组 成。
[0009] 又一个方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体而增强受试者对革兰 氏阴性细菌免疫应答的方法。增强的免疫应答可以是增强的抗体应答、增强的T细胞应答 或两者皆有。
[0010] 又一个方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体而降低受试者和革兰 氏阴性细菌感染相关的发病率或死亡率的方法。与对照相比，在施用疫苗载体的受试者中， 疫苗载体能够降低与继发革兰氏阴性细菌感染相关的发病率和死亡率。
【附图说明】
[0011] 图1的图显示，以IO8Cfu/鸡通过盐水、或芽孢杆菌属骨架（BS BB)或PAL-载体 化BS疫苗（BS PAL)候选物的口服灌胃所进行的接种后第17天，用合成PAL-BSA作为包 被抗原，通过ELISA确定PAL序列特异性血清IgG抗体水平。结果表示为S/P比的平均值 土SEM(n = 10)。使用AN0VA，不同大写字母的组显著不同（P〈0. 05)。
[0012] 图2的图显示，以IO8Cfu/鸡通过盐水、或芽孢杆菌属骨架（BS BB)或PAL-载体 化BS疫苗候选物（BSNNP)的口服灌胃所进行的接种后第17天，用合成PAL-BSA作为包被 抗原，通过ELISA确定PAL序列特异性回肠 SlgA抗体水平。结果表示为S/P比的平均值 土SEM(n = 10)。使用AN0VA，不同大写字母的组显著不同（P〈0. 05)。
[0013] 图3的图中，在接受了 IO8Cfu/鸡的盐水、BSBB或PAL-BS构建体载体化疫苗 (BSNNP)的鸡中，在孵化后第17天和第21天使用常规微生物学铺板计数法来计算鼠伤寒沙 门氏菌（Salmonella typhimurium)。所有组在孵化后的第11天接受IX 10scfu/ml ST挑 战剂量。结果表示为盲肠含量的平均IogwCfu/克+SEM(η = 10)。通过AN0VA，不同大写字 母的组显著不同（Ρ〈〇. 05)。
[0014] 图4的图显示，与对照（PBST)相比，两个单克隆抗体（2Β5和1Β2)对指定的PAL 六肽的亲和性。
[0015] 图5的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，从21日龄雏鸡盲肠中分离的海德 堡沙门氏菌（Salmonella Heidelberg)的每克菌落形成单位（cfu)。通过AN0VA，不同大写 字母的组显著不同（P〈〇. 05)。
[0016] 图6的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，从21日龄和33日龄雏鸡盲肠中 分离的海德堡沙门氏菌的每克菌落形成单位（cfu)。通过AN0VA，带星号的组显著不同 (Ρ〈0· 05) 〇
[0017] 图7的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，来自28日龄雏鸡盲肠中的海德堡 沙门氏菌的阳性回收百分比。通过AN0VA，不同大写字母的组显著不同（Ρ〈0. 05)。
[0018] 图8的图显示，指定疫苗株的小鼠巨噬细胞的吞噬百分比。通过AN0VA，不同大写 字母的组显著不同（Ρ〈〇. 05)。
【具体实施方式】
[0019] 抗革兰氏阴性细菌的常规疫苗通常基于活的/减毒的细菌，其常常以受控数目通 过注射进行递送。革兰氏阴性细菌非常多样，不同物种的细菌之间、甚至是相同物种内的不 同株之间的抗原多样性已经使得针对一种以上的单株或血清变种的接种变得困难。已经开 发了重组疫苗，但由于抗原的多样性，重组疫苗一般只限于增强对单一物种或甚至细菌的 单一株的免疫应答。能够保护免受多个血清变种以及确实免受一种以上革兰氏阴性细菌物 种的疫苗将是最佳的。此外，可以口服的疫苗会使施用更便宜，更具顺应性（compliance)。 提供了一种疫苗，其包含PAL的高度保守区域，PAL是一种广泛发现于革兰氏阴性生物中的 肽聚糖相关脂蛋白。
[0020] 重组DNA技术使操作许多酵母、细菌和病毒物种变得相对容易。一些微生物是轻 度致病性的或非致病性的，但是能够产生强烈的免疫应答。这些微生物成为有吸引力的疫 苗载体，用于激发对载体中所重组表达的抗原的免疫应答。以微生物作为载体的疫苗可以 模拟天然感染，有助于产生强且持久的粘膜免疫，而且生产和施用相对便宜。许多这些疫苗 载体可口服施用，降低了成本和对专业施用人员的需要，并降低了施用抗性。此外，这样的 载体经常携带一种以上的抗原，并具有提供保护以免受多重感染原（infectious agent)的 潜能。
[0021] -种疫苗，包含任何含有编码抗原性多肽的多核苷酸的组合物，其中抗原性多肽 能够激发对多肽的免疫应答。疫苗载体是可被工程改造成携带抗原和任选其它免疫刺激多 肽的组合物，并且还可以包含佐剂、或与佐剂一起施用以进一步提高对寄生虫的免疫应答， 并提供更好的保护免受继发感染相关的发病率和死亡率。此处公开了载体如细菌、病毒或 酵母载体用于接种和产生对肠病原体的免疫应答的用途。肠病原体可以包括，但不限于大 肠杆菌（E. coli)、沙门氏菌属（Salmonella)以及实施例表1中公开的其它肠微生物。施用 此处所述疫苗载体后的免疫应答不需要是完全保护性的，但可降低肠病原体继发感染相关 的发病率或死亡率百分比（即，死亡的概率）。
[0022] -方面，提供了一种疫苗载体，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列 编码SEQ ID NO: 1-6、32、36或37中的至少一个，或编码这些序列中任何一个的至少6个氨 基酸长的免疫原性片段。提供了疫苗载体，其也可包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编 码免疫刺激多肽。适当地，PAL多肽或其免疫原性片段以及免疫刺激多肽表达在疫苗载体的 表面上。SEQ ID NO :1多肽的免疫原性片段可包含SEQ ID NO :2-5或36-40中的任意一个 或其组合、或者至少六个氨基酸的任何其它片段。例如，抗原性多肽可包含、基本上由以下 组成或由以下组成：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、或任意这些 SEQ ID NO 的 免疫原性片段或组合。
[0023] 抗原性多肽的免疫原性片段可以是至少6、8、10、12、14、16、18或20个氨基酸长， 并和此处所提供的SEQ ID NO具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%百分比同一性的序列。一种疫苗，包含任何含有编码抗原性多肽的多核苷酸的组合 物，所述抗原性多肽能够在施用该疫苗的受试者中激发对多肽的免疫应答。公开了载体如 细菌载体用于接种和产生对肠细菌的免疫应答的用途，肠细菌包括但不限于沙门氏菌属 (Salmonella spp)、埃希氏菌属（Escherichia spp)、志贺氏菌属（Shigella spp)、弧菌属 (Vibrio spp)、欧文氏菌属（Erwinia spp)、克雷伯菌属（Kebsiella spp)、枸橡酸杆菌属 (Citrobacter spp)、耶尔森氏菌属（Yersinia spp)、普罗维登斯菌属（Providencia spp) 或类似细菌，比如表1中列出的那些。
[0024] 编码此处提供的抗原性多肽或者编码来自任何数目致病性生物的其它抗原的多 核苷酸可插入到载体中，并在载体中表达。在载体中表达这些多核苷酸将允许在免疫受试 者之后产生对抗原性多肽的免疫应答。多核苷酸可以插入到载体的染色体中或者编码在质 粒或其它染色体外DNA上。本领域技术人员将理解，存在多种用于在载体（如沙门氏菌属 或芽孢杆菌属）中获得多核苷酸表达的方法。通过本领域技术人员已知的方法，多核苷酸 可以可操作地连接到启动子（例如，组成型启动子、诱导型启动子等）。适当地，编码抗原性 多肽的多核苷酸被插入到载体中，例如细菌载体，从而表达该