em Sci 25:147-50)来证实所选序列的抗原性潜力。然后，使用瑞士生物信息 研究所的Blast搜索引擎在EXPASY服务器上，将序列用于搜索序列同源性。Blast搜索发现 了与我们最初选择的Pal序列（TVEGHA DERGTPEYNISLG(SEQ ID N0:8))具有相同序列的一 些蛋白（Pal)。具有相同序列的Pal蛋白列表包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi)和副伤寒菌属（paratyphi spp)、志贺菌属、肠杆菌属（Enterobacter spp)、枸橡酸 杆菌属、阪崎肠杆菌属（Cronobacter spp)。此外，具有大于94%同源性（仅一个氨基酸不 同，有或没有第二个氨基酸的相似取代）的Pal蛋白是具有100%覆盖率（coverage)的弧 菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、沙雷菌属（Serratia spp)、变 形杆菌属（Proteus spp)、异短杆菌属（Xenorhabdus spp)、果胶杆菌属（Pectobacterium spp)和泛菌属（Pantoea spp) 〇
[0069] 为了优化用于其它病原体物种的抗原，第17个氨基酸将被从丝氨酸变为丙氨酸。 新的序列将是TVEGHADERGTPEYNIALG(SEQ ID N0:32)。预期这个序列为具有100%覆盖率 和相同或相似氨基酸序列的弧菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、 沙雷菌属、变形杆菌属、异短杆菌属、果胶杆菌属和泛菌属提供最佳的免疫刺激。预期接种 之后免疫系统将靶向这些物种的蛋白，并提供针对这些生物的保护。
[0070] Pal 表位（TVEGHADERGTPEYNISLG(SEQ ID NO :8))插入枯草芽孢杆菌（BS)载体并 进行表达。随后，在孵化当天通过口服灌胃IO8Cfu/鸡对鸡进行接种，将Pal芽孢杆菌构建 体作为疫苗载体针对沙门氏菌属进行测试，并且与用芽孢杆菌属骨架（BS BB)或盐水相似 处理的鸡进行比较。在孵化后第11天用相同的处理对鸟进行加强。在第17天，收集样本 用于特异性免疫应答。通过测量血清IgG(图1)和分泌型回肠 IgA(图2)评价对疫苗的免 疫应答。与对照组相比，接种表达在芽孢杆菌上的所选Pal序列后，出现特异性针对Pal序 列的显著血清和分泌免疫应答（图1和2)。
[0071] 通过计数孵化后第17天和21天（或挑战后第6和10天）经过接种的鸡的盲肠 中沙门氏菌的菌落，评估潜在的针对在接种后第11天的鼠伤寒沙门氏菌（ST)挑战的芽孢 杆菌载体化的疫苗候选者。使用常规的微生物学技术测量盲肠中ST的水平。接种有表达 在芽孢杆菌载体上的所选Pal序列的鸡，具有显著降低的盲肠沙门氏菌属水平。如图3所 示，和接种盐水或BS BB的鸡相比，在接种BS-PAL(BSNNP)的鸡中沙门氏菌属在盲肠中的水 平降低了超过4V2l〇g。这是针对沙门氏菌属第一个有效的疫苗，它被食品和药品监督管理 局（FDA)认为有资格作为公认安全（GRAS)的生物如枯草芽孢杆菌所载体化。
[0072] 在旨在优化免疫原序列的研究中，所述免疫原序列称为上述 PAL(TVEGHADERGTPEYNISLG(SEQIDN0:8))，设计表位测绘实验来评价这种19-mer寡肽 PAL各部分的相对抗原性。序列分成7个六肽，彼此重叠3个氨基酸。例如，TVEGHA (SEQ ID N0:39)、GHADER(SEQ ID N0:2)和 DERGTP(SEQ ID N0:3)，各个肽在序列的最左侧（朝向氨 基端）和最右侧（朝向羧基端）部分共享三个氨基酸。为了这个目的，合成了跨越氨基酸 残基1-3、4-6、7-9等的七个六肽，并偶联至牛血清白蛋白（BSA)。选择与PAL 19-mer肽和 沙门氏菌（以及相关物种）细胞壁展示的天然表位发生强烈反应的两个单克隆抗体（mAb， 指定为2B5和1B2)，并且测试它们对PAL各个区段的相对亲和性（图4)。
[0073] 结果表明，试验的7个肽当中，PALl (3个残基的前-PAL (pre-PAL)"YKV"，以及PAL 氨基端残基"TVE"；SEQ ID NO :38)对于两个mAb是抗原性最弱的。通过观察这可以解释 为，苏氨酸是不带电的氨基酸而缬氨酸是脂肪族残基，两者都是相对疏水的，因此不太可能 在原始免疫原PAL中被接近。少被接近的残基不太可能诱导强的免疫应答。此外，大多数 抗体表位天然上是亲水性的。与此相反，两个反应性最好的mAb对PAL6 (SEQID NO :4)和 PAL7(SEQ ID N0:6)有更高的亲和性（相比PAL1，对于PAL6的ELISA吸收水平是两倍高， 以及对于PAL7是>50%更高）。这些结果清楚地表明PAL在C端的一半可能更加暴露并且 是免疫原容易接近的部分以及对于产生抗体群而言是免疫原最关键的部分，该抗体群与沙 门氏菌和相关细菌物种上呈现的天然蛋白强烈地交叉反应。有趣的是，为了产生PAL7六 肽，加入了不是原始19-mer PAL -部分的且在天然细菌蛋白中位于PAL两侧的2个残基： E(谷氨酸）和R(精氨酸）。两者都是带电荷的残基，因此具有高的暴露于我们细菌靶标物 种的概率。
[0074] 基于上述理由，生成了新的19-mer，其指定为PALbis (SEQ ID NO :1)。PALbis不 同于原来的PAL 19-mer :在于（1)它不再包含两个N端氨基酸T (苏氨酸）和V (缬氨酸）， 以及⑵它的C端延长了两个额外的残基，即E(谷氨酸）和R(精氨酸）。因此，改进的氨 基酸序列 PALbis 是 EGHADERGTPEYNISLGER(SEQ ID NO :1)。将 PALbis 和细菌的多个属进 行比较，以确保保留跨物种的反应性（BLAST结果示于表1)。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和 和副伤寒菌属、志贺菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和阪崎肠杆菌属之间的序列同源性仍然 有100%同源性。弧菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、沙雷菌属、 变形杆菌属、异短杆菌属、果胶杆菌属和泛菌属间的序列同源性为95 %同源性，具有单个氨 基酸取代S15A(SEQ ID N0:6)。相关的空肠弯曲杆菌序列示为SEQ ID N0:7,并且和SEQ ID NO :1的序列具有65%的同一性。因此，我们选择使用表达SEQ ID NO :1的疫苗载体来 获得单个疫苗载体的跨-株的免疫反应。
[0075] 表1 :细菌之间的PALbis (SEQ ID NO :1)序列比较
[0076] PALbis 序列：
[0077] EGHADERGTPEYNISLGER 大肠杆菌（SEQ ID NO: 1)
[0078] EGHADERGTPEYNIALGER 弧菌属（SEQ ID N0:6)
[0079] EGNCDEWGTDEYNQALG_ 弯曲杆菌属（SEQ ID NO:7)
[0080] L/1N 丄 UD 丄 Λ * * 1 * 丄 d/ 丄 O χ
LziN 丄 UD 丄 Λ * * 1 * 丄υ/ 丄 O χ
[0082] 为了测试PALbis(SEQ ID NO :1)在跨-株挑战实验中发挥作用的能力，产生几个 候选疫苗。基本上如国际公开号W02008/036675和国际公开号W02011/091255所描述的，产 生此处所用的疫苗载体。产生三个单独的构建体，并入两个独立的疫苗载体，肠炎沙门氏菌 或鼠伤寒沙门氏菌。所用的插入包括编码CJ0113表位的多核苷酸（此处描述为SEQ ID NO: 31，最初描述于国际公开号W02011/156619)、编码SEQ ID N0:24的HMGBl多肽（最初描述 于国际公开号W02011/091255)的多核苷酸以及此处鉴定并描述的SEQ ID N0:1的PALbis 序列。三个多核苷酸被丝氨酸间隔隔开（插入三个丝氨酸残基以避免空间位阻问题）并在 阅读框内以各种顺序插入沙门氏菌跨膜蛋白IamB的外环9。所得插入的核酸和氨基酸序列 显示于SEQ ID N0:41-46，SEQ ID N0:41和42分别是CJ0113-PAL-HMGB1插入的核酸和氨 基酸序列。SEQ ID N0:43和44分别是CJ0113-HMGB1-PAL插入的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO :45和46分别是HMGB1-CJ0113-PAL插入的核酸和氨基酸序列。产生三个以各种顺 序带有相同插入的疫苗载体的目的是控制多肽的任何位置或空间位阻影响，其和未经测绘 的载体试剂上的表面基团（moiety)相互作用，从而使得HMGBl结合结构域不易被宿主细胞 上的受体所接近，或者可能使得表面所呈现的抗原不易被宿主免疫细胞所接近。
[0083] 肠炎沙门氏菌载体化的疫苗降低了挑战后海德堡沙门氏菌的回收。当和海 德堡沙门氏菌挑战株比较时，给鸡接种属于异源沙门氏菌血清群的肠炎沙门氏菌载体 化的疫苗以确定PAL抗原是否会产生跨沙门氏菌血清群的免疫应答。在1日龄的鸡 中，以4x IO8Cf u/鸡，口服灌胃活的肠炎沙门氏菌-CJO113-PAL-HMGB1、活的肠炎沙门氏 菌-CJ0113-HMGB1-PAL(其之后被确定在HMGBl中含有两个点突变以及在PAL中有移框突 变，而产生SEQ ID NO :35的PAL表位）以及活的肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL(其 之后被确定在HMGBl中含有点突变）疫苗。在第7天以7xl06cfu/鸡用海德堡沙门氏菌 通过口服灌胃对鸡进行挑战。确定分离自21日龄雏鸡盲肠的海德堡沙门氏菌的每克菌 落形成单位（cfu)。活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1所接种的鸡在挑战后14天， 回收自盲肠的海德堡沙门氏菌cfu/g显著低于来自活肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL 所接种的鸡（在HMGBl中带有两个点突变以及在PAL中有移框突变）、活的肠炎沙门氏 菌-HMGB1-CJ0113-PAL(在HMGBl中带有点突变）所接种的鸡以及未接种的对照鸡（图5， P = 0· 003) 〇
[0084] 当和海德堡沙门氏菌挑战比较时，鸡还接种有属于异源沙门氏菌血清群的 戊二醛失活的肠炎沙门氏菌载体化的疫苗以确定PAL抗原是否会产生跨沙门氏菌 血清群的免疫应答。戊二醛失活的肠炎沙门氏菌-CJOl 13-PAL-HMGB1、肠炎沙门氏 菌-CJ0113-mHMGBl-mPAL(在HMGBl中带有点突变以及在PAL中有移框突变）、肠炎沙门 氏菌-mHMGBl-CJ0113-PAL(在HMGBl中带有点突变）疫苗以甘露糖化壳多糖为佐剂（如 国际申请号PCT/US13/67212中描述的）。以IXlO9Cfu/鸡，将所制备的疫苗用于口服 灌胃1日龄的鸡。在第17天以8. 5xl06cfU/鸡用海德堡沙门氏菌通过口服灌胃对鸡进 行挑战。挑战后五天，在雏鸡中的戊二醛失活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1接种 和肠炎沙门氏菌-mHMGBl-CJOl 13-PAL接种，显著降低来自盲肠的海德堡沙门氏菌的回收 (图6 ;P〈0. 05)，并且挑战后十七天，在肠