自体骨髓源性干细胞的快速输注的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请主张于2013年1月12日提交的美国临时申请，申请序列号为61/751846 的优先权，所述申请公开的内容以引用方式全文明确地并入于此。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种快速即时检测（point-of-care)的方法和具有细胞群的组合物， 所述快速检测方法用于对个体抽吸、分离、检测和递送预设剂量和粘度的获取自骨髓的细 胞群及附带的因子（accompanying factors);所述包含于组合物中的细胞群包括骨髓干细 胞和/或祖细胞、抗凝剂以及37°C测量时小于或等于5.0厘泊（cP)的粘度。
【背景技术】
[0004] 心血管疾病（CVD)是全球发病和死亡的首要原因。2008年，估计有1730万人死 于CVD，占全球死亡总数的30%。在这些死者中，估计730万人死于冠心病，620万人死于 脑卒中。更值得注意的是，低收入和中等收入国家不相称地被影响，推动对代替慢性药物治 疗方案的再生疗法的需求，这种再生疗法必需以消除对高成本实验基础设施或血管导管实 验室广泛多小时使用的需求的形式提供。超过80%的CVD死亡发生在低收入和中等收入国 家，在男性和女性中几乎均等地发生。在CVD的病程中，动脉中发展出斑块损伤，其导致血 管狭窄，并且在重症患者中，所述斑块病变脱落（break open)，在心脏、脑或肢体的重要部 位产生血流阻断（缺血）。若短期内通过再灌注治疗，以及进一步在有或没有胞外因子的 存在下通过成体组织源性干细胞的输注进行治疗，这种缺血是可能被逆转的。尽管医学治 疗以及血管重建策略已有重大进展，但是若在早期不引入生物修复干预，患有急性心肌梗 死（AMI)、慢性心力衰竭（CHF)、严重肢体缺血（CLI)和缺血性脑损伤（脑卒中）的特定患 者的预后仍会不良。
[0005] 与再灌注一起，辅助干细胞疗法对缺血性损伤所造成的心脏、脑和肢体受损组织 的修复和再生已显示出潜在有效性。可从不同来源分离出这些干/祖细胞，其中一个来 源是骨髓。自体的，骨髓源性为一种情况，外周血源性为第二种情况，脂肪源性为第三种情 况，这类成体干/祖细胞规避了与胚胎干细胞相关的道德和法律问题。此外，它也终止了 疾病传播和免疫排斥的风险。自体干细胞（具体是脂肪或外周血，最具体是骨髓源性细胞 产品）的再生潜能受所采用的抽吸、处理和递送技术的高度影响。抗凝剂在再生细胞治疗 的整体功效中起到了非常重要的作用，且长时间暴露于抗凝剂中已显示出对细胞的"干性 (sternness) "具有负面的影响。在抽吸注射器和处理装置中使用抗凝剂让骨髓保持在非凝 固态，使得干/祖细胞适当地分层、分离及输注以治疗临床病症。抗凝剂也在不同程度上抑 制微血栓（microthrombae)的形成，若其被注入患者体内可能导致不良事件。也能理解的 是在蛋白质或细胞（"生物制剂"）的存在下，任何化学个体的加入都可能对所述生物制剂 的结构或功能具有影响。因而，所用的抗凝剂、所用的浓度以及细胞暴露于抗凝剂中的时间 单独地、潜在地、累计地对干细胞治疗功效和安全性的整体效果起到至关重要的作用。理想 的干细胞相容的抗凝剂必须处于最优的浓度比率平衡，以在一段限定的时间内维持细胞治 疗浓缩物或输注物处于抗凝态，以完成介入步骤，并减少或消除血管内血栓的形成同时最 小化围手术期出血和干细胞调控（modulation)的风险。
[0006] 肝素是骨髓抽吸中最常用的抗凝剂。但是已被报道肝素会干扰干细胞和/或祖细 胞的移动和归巢机制（homing mechanism)，从而削弱这些细胞的功能治疗能力。此外，肝素 与围手术期出血的高发率有联系，这可能与它们不能和连于凝块上的凝血酶（clot-bound thrombin)结合相关。更进一步地，在体内通过将肝素与血小板因子-4(PF-4)结合，所述肝 素可被灭活。对肝素-PF-4复合物表达抗体的某些个体暴露于肝素时，会经历肝素诱导的 血小板减小症（HIT)。
[0007] 抗凝骨髓抽吸物处于异源混合物（包括造血干细胞（"HSC"）、间充质干细胞 (皿3〇、内皮祖细胞（1?(："）、0父0?4阳性细胞、白血球（"冊(："）、红血球（"1?(："）、血小板 ("PLT"）、含血清蛋白和代谢物的血浆（"PLASMA"）和脂肪（"FAT"））中，且不适用于以 原始抽吸物形式直接递送到患者的血管系统中。此外，为了可重现的病人到病人的治疗功 效以便正确地限定治疗细胞混合物的一致性（constituency)，以及为了制备治疗细胞浓缩 物的安全的剂量特定体积（dose specific volume)，必须在短时间内从无效的和非预期的 细胞与脂肪中纯化、分离或捕获治疗有效的细胞（HSC、MSC、WBC、EPC和CXCR4阳性细胞）， 以在即时检测中产生浓缩的治疗剂量的细胞及因子。
[0008] 细胞的纯化，具体是包含所需HSC、EPC、MSC和其他干/祖细胞的WBC的纯化，历史 上通过如下方法完成：将所述细胞置于封闭装置（containment device)中，并在重力下使 用基于化学密度的方法或基于自动的不含化学品的系统采用标准离心分层。在一段限定的 时间内，源自红骨髓和间质的骨髓细胞在特定的重力（"g力"）下，将依据它们各自的密度 分层，从而自下而上在所述封闭装置中产生细胞层，其中RBC(最稠密的）在底部，随后是有 核的RBC和VSEL、WBC、PLT、PLASMA和FAT。两种方法都简单地获得血沉棕黄层，其典型地 被限定为RBC/成核RBC部分之上和PLT部分之下的细胞层。
[0009] 理想的细胞纯化流程包含闭合的最小化操控步骤（closed minimally manipulated procedure)，用于从不需要的成熟RBC中快速分层与分离所需的HSC、EPC、 MSC以及其他干/祖细胞，这些细胞在本文中也可被称为干细胞或MNC或祖细胞或骨髓浓缩 物富集的祖细胞（BMCePC);并以PLASMA注满所需细胞成分至出于安全考虑的合适的体积 和粘度，并通过干细胞友好的装置（如整体交换（over the wire)球囊导管或器官内递送 套管）有效地递送至血管系统。
[0010] 通过导管操作递送干细胞是向近端受累器官输注细胞的理想方法。但是，经导管 传输的细胞在若干方面对所需细胞可能具有潜在的负面影响。首先，细胞承受变化的剪切 应力，这取决于它们与内腔壁接近度、注射速率、内腔半径及流体的粘度；其次，由于内腔是 聚合物基质，其可潜在地影响细胞和细胞膜，其通过活化、结合或脱落而产生的接触会是重 要的。
[0011] 经导管递送干细胞至血管系统期望通过如下方法实现：在外周血管中引入血管内 导管，并通过充气血管内囊，在一定预设时间内减缓或阻止血流，在导管尖的近端或末端的 目标器官中诱导暂时性缺血。这种缺血改善干和祖细胞到缺血组织的归巢，并增加细胞引 发一个或多个过程的机会，所述过程包括但不限于：组织整合、细胞融合、细胞分化和/或 旁分泌因子释放。通过对顺应性或非顺应性囊充气以减少或阻止血流来最佳诱导缺血，同 时加倍注意从而最小化任何源自囊增压的内皮壁损伤。
[0012] 因此，需要一种改善的方法和组合物，用于骨髓细胞的抽吸、处理和递送，以使骨 髓源性干细胞为缺血性疾病的血管再生和/或器官修复提供安全和有效的辅助治疗。
【发明内容】
[0013] 已开发出快速和有效的方法及完备的即时检测试剂盒，其用于在短于90分钟的 时间内对分离自骨髓的自体干细胞及因子的抽吸、处理和输注。在一些实施方案中，用于骨 髓采集和处理的方法包括一定量或浓度的抗凝剂，优选是比伐卢定，其最小化凝块形成的 时间达90分钟，而不影响干细胞治疗的功效。
[0014] 本发明所描述的一些实施方案产生了预期的包括干细胞和/或祖细胞的混合物， 所述混合物包含血沉棕黄层干细胞和/或祖细胞，如与取自骨髓的普通细胞群相比，具有 减少或降低量的红细胞（RBC)的造血干细胞（HSC)、间充质干细胞（MSC)、内皮祖细胞（EPC) 和CXCR4阳性细胞。
[0015] 本发明所描述的一些实施方案提供了在即时检测环境中的快速细胞输注物分析， 保证了用于细胞治疗的充足而有活力的剂量。
[0016] 本发明所描述的一些实施方案，在受控的粘度和流速下通过手动或计量机制输注 细胞群，所述细胞群含有一定粘度下的骨髓源性干细胞和/或祖细胞，所述粘度在正常人 体温度下测量（如：37°C时粘度为 5. 0cP、4. 5cP、4. 0cP、3. 5cP、3. 0cP、2. 5cP、2. 0cP、l. 5cP 或1.0 cP)，以确保有活力的和有效的细胞剂量可经导管注射被递送，同时最小化剪切应力。
[0017] 本发明所描述的一些实施方案，经导管输注上文所述的细胞群混合物，所述导管 包括适当和安全的囊充气控制机制。
[0018] -些实施方案包含了除氯化钠缓冲剂外作为唯一添加的化学品的抗凝剂。在一些 实施方案中所述抗凝剂是比伐卢定。与许多抗凝剂不同的是，比伐卢定产生很少溶血或不 产生溶血。
[0019] 本发明的实施方案也包括一次性离心细胞分层装置，其可具有可控的阀门，能够 对电机驱动的开关位置做出响应或可具有密度功能分离装置，以可采集位于所述装置之上 或之下的骨髓源性细胞群。一些实施方案包括了任选的装载固件，用于控制多层区域特定 细胞群的问询（interrogation)和采集，其通过光源透射值对预设光单元的响应不同或密 度等于目标细胞密度对质量比率的等密度分离装置驱动，上述一些实施方案还包括用于核 实特定细胞群或细胞剂量和特定群粘度的快速分析仪器，以及血管内囊导管，其中对位于 目标器官近端的所述囊在规定时限内进行充气，阻止80-100%的血流以诱发缺血。在一些 实施方案中，所采集的细胞和因子的受控最低细胞剪切输注导致减轻程度的细胞凋亡或其 他细胞死亡，所述输注经套管腔，以0. 5mL-2. 5mL每分钟的速度由装置进行控制或计量，所 述装置例如是机械栗或可解释为在线式手动压力计的手动控制法。
[0020] 本公开通过引用进一步总结得到下述实施方案：
[0021] 1. 一种组合物，其包括：
[0022] (a)包含骨髓干细胞和/或祖细胞的第一细胞群，
[0023] (b)抗凝剂，以及
[0024] (c)缓冲水溶液和/或自体血清和/或自体血浆成分，
[0025] 其中所述组合物具有的粘度在37°C测量时不大于5. 0厘泊（cP)。
[0026] 2.实施方案1所述的组合物，其中含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞 群是自体的。
[0027] 3.实施方案2所述的组合物，其中含有骨髓干细胞和/或祖细胞的所述第一细胞 群源自所述患者骨骼中的髓腔。
[0028] 4.实施方案3所述的组合物，其中所述骨骼是髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、胸骨或肋 骨。
[0029] 5.实施方案3所述的组合物，其中包含骨髓干细胞的所述第一细胞群源自髂嵴腔 中的髓腔。
[0030] 6.实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂选自由香豆素、维生 素 K拮抗剂、间接凝血酶抑制剂、肝素、因子Xa抑制剂、直接凝血酶抑制剂、巴曲酶、血红素 (hemetin)、纯化的植物提取物、EDTA、梓檬酸盐、草酸盐和硝基血红素（nitrophorin)组成 的组。
[0031] 7.实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂是直接凝血酶抑制剂。
[0032] 8.实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述抗凝剂包含比伐卢定。
[0033] 9.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有lmg/mL-50mg/mL的浓 度的储备溶液。
[0034] 10.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有5mg/mL-35mg/mL的 浓度的储备溶液提供。
[0035] 11.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有10mg/mL-25mg/mL的 浓度的储备溶液提供。
[0036] 12.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有18mg/mL-22mg/mL的 浓度的储备溶液提供。
[0037] 13.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定提供自具有20mg/mL的浓度的储 备溶液提供。
[0038] 14.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以lmg/mL-3mg/mL的浓度存在于 所述组合物中。
[0039] 15.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以I. 5mg/mL-2. 5mg/mL的浓度存 在于所述组合物中。
[0040] 16.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以I. 8mg/mL-2. 2mg/mL的浓度存 在于所述组合物中。
[0041] 17.实施方案8所述的组合物，其中所述比伐卢定以2mg/mL的浓度存在于所述组 合物中。
[0042] 18.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37°C测量的所述粘度是 1.0 cP-5. OcP0
[0043] 19.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37°C测量的所述粘度为 I. 8cP-3. OcP0
[0044] 20.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37°C测量的所述粘度为 2. OcP-2. 5cP〇
[0045] 21.实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中在37°C测量的所述粘度为 3. lcP-5. OcP0
[0046] 22.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含离子盐。
[0047] 23.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含氯化钠。
[0048] 24.实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲水溶液包含氯化钠，且 所述组合物中所述氯化钠的量是0. 9%。
[0049] 25.实施方案1-24中任一项所述的组合物，其中包含骨髓细胞的所述细胞群包括 单核细胞，所述单核细胞包