专利名称：：含胶原蛋白的细胞载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含胶原蛋白的组合物用于培养生物细胞的用途、一种用于培养生物细胞的方法、一种用于植入生物材料至生物体内的方法以及一种用于增进组合物供培养生物细胞的适合性方面的方法。
背景技术：
：用于培养生物细胞的载体在本领域中通常是已知的。这些载体通常意指为基质或支架(scaffold)。这些载体提供繁殖场(breedingground)或一般地细胞培养物中细胞生长于其上的基础。含胶原蛋白的化合物代表细胞载体最被熟知的类型。胶原蛋白(作为细胞外基质的一种动物蛋白)属于硬蛋白(scleroprotein)并且通常是水不溶性的以及在结构上是纤维性的。它在结缔组织(例如皮肤、血管、韧带、腱以及软骨)的结构中，以及在骨与牙齿的结构中是重要成分之一。因为这些特质，来自生物来源的以胶原蛋白为基础的生物材料至今早已被用于医学上达数年。特别在用于止血的临床应用产品上，作为硬脑膜(dura)的置换或用于整形外科的不同领域中，胶原蛋白本身能够建立作为载体材料。迄今，这些胶原蛋白之中有28种不同类型已被鉴定并且至少10种具有胶原蛋白样域的额外蛋白质已被记录，这些胶原蛋白显示在独立物种之间的些微差异。因为尚未发现一种明确的识别模式且它们的以酶为基础的降解不会产生任何毒性的降解产物，胶原蛋白被认为是生物相容的。目前在市场上所供应的胶原蛋白基质在它们的性质上显示非常大的差异性。因此，据发现，当被体外使用时，某些用于培养生物细胞的胶原蛋白基质会造成炎症反应，致使分解代谢过程。目前可用的胶原蛋白基质的另一个缺点是它们非常厚-通常超过200iim-并且因此它们无法在显微镜下被检验。除此之外，目前被供应用于培养生物细胞的胶原蛋白基质非常昂贵。用于培养细胞的另一种替代性载体是所谓的水凝胶(hydrogel)。水凝胶是一种含水的但水不溶性的聚合物，其分子是化学地(例如通过共价或离子键)或物理地(例如通过交联聚合物链的方式)被连接以生成一种三维网状结构。因为整体亲水性聚合物成分，它们在水中摄入相当多体积的水之后膨胀但并不丧失它们的材料凝聚。然而，水凝胶的缺点是，鉴于它们巨大的保水能力，它们是机械上不稳定的。再者，水凝胶经常在与细胞形成集落的期间凝縮。因此，水凝胶在它们的使用上是非常受到限制的。所谓透明质酸代表另一种适合用于生物细胞形成集落的基质。这一基质由软骨基质的巨分子组成，这是它(呈未经修饰的形式)显示高度的生物相容性的原因。分子链必须被连接以产生具有足够机械弹性的适当结构。这是通过与醇的酯化作用而被完成，这会造成生物相容性的降低。所谓藻酸盐代表另一种支架。这涉及从褐藻获得的共聚物，其由L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸构成。通过添加EDTA和/或Na-柠檬酸，产物可以被凝胶化或液化，其给予藻酸盐类似于基于胶原蛋白的凝胶的用于培养细胞的那些已被描述的性质，然而增进了供细胞以及分子生物学分析的再悬浮可能性。尽管优于其他载体基质的优点以及材料在体外的良好性质，当它被用于体内时是不成功的。在体内，该物质难以吸收并且造成相当大的免疫和异物反应。因此，藻酸盐还不适于被用作为用于人体植入物的载体。另一种用于生物细胞的载体材料是琼脂糖。它表现类似于藻酸盐。琼脂糖由两个糖链构成并且从红藻的细胞壁获得。就像藻酸盐，当被体内使用时，它会造成免疫和异物反应，使得琼脂糖不能被用于人类植入物。其他的支架是基于纤维蛋白。这涉及一种球状血浆蛋白质，其特别因为网状(meshing)聚合作用的能力而造成血液凝结。然而，迄今纤维蛋白还未经过活体内使用的试验。使用纤维蛋白作为细胞载体仍有很大一部分是未被考察的并且仍然必须被深入地评估。再者，纤维蛋白是非常昂贵的。被用于培养生物细胞的其他基质是基于几丁质或脱乙酰壳多糖。几丁质形成生产脱乙酰壳多糖的基础材料。为此目的，几丁质的乙酰基团被化学地或酶促地切去。几丁质与脱乙酰壳多糖两者是无法通过一种明确界定的界面(crossover)而被分离的生物聚合物。通常当脱乙酰的程度高于40_50%且化合物可溶于有机酸中时称为脱乙酰壳多糖。然而，几丁质与脱乙酰壳多糖在它们的应用性上是非常有限的，并且本身当被用于培养细胞时同样是未经证实的。几丁质不是一种在体内被制造的材料，因此，它在生物体内是一种异物。使用几丁质作为细胞载体仍然必须被根本地研究。目前，亦有大量的合成支架被测试。这之中包括聚合物聚交酯(PLA)和聚乙交酯(polyglycolide，PGA)以及聚L-乳酸PPLA(亦称为"生物玻璃(bioglass)")。PLA和PGA的特殊特征是它们在水性介质中的低溶解度，仅能通过聚合物链分解(亦即水解)成低分子寡聚物或单体而改善溶解度，因此导致这些材料的侵蚀。然而，已显示这些聚合物不适于培养生物材料。通过自发性的水解，可吸收的聚合物分解并生成有机酸。成骨细胞在酸性环境中分化以使得较高量的这些聚合物可能造成骨破坏而非造骨。
发明内容对照此背景，本发明的根本目的是提供一种用于培养生物细胞的新颖组合物，其避免本领域中的细胞载体所已知的缺点。特别地，提供一种可以经济地大规模并且以恒定的高品质制造的组合物。这个目的是通过包含有下列参数的组合物在培养生物细胞中的应用来解决的胶原蛋白[Wt%]:大约30至80，酰胺氮[Wt%]:大约0.06至0.6，多元醇[Wt%]:大约0至50，脂肪[Wt%]:大约0至20，灰分[Wt%]:大约0至10，水[Wt%]:大约5至40，pH值大约3至10，每单位面积重量[g/m2〕:大约10至100，抗张强度[N/mm2]:大约0.5至100，或20至100。5此组合物以薄膜的形式可由NaturinGmbH&Co.KG，Badeniastrasse13，Weinheim商业上取得。由Naturin指定的这些薄膜的参考编号是例如400011899、400023747、400024203、400026193、400019485、400000084和400000109。这个发现是令人惊讶的。至今，此组合物被专门地使用在食品工业中，例如在火腿制造的领域中作为一网(net)与肉之间的分离膜。尤其，没有预期这些组合物特别适用于培养生物材料。依据本发明的组合物可以大规模地并且以稳定的高品质被再现。因为它具有优良的生物相容性、极薄的膜厚度、相对高的透明度以及高机械稳定性而特别突出，导致广泛的应用范围。再者，优选的是甘油或山梨醇被用作为多元醇，它是以0至50wt^(甘油)和/或0至40wt%(山梨醇)的浓度被提供。这个措施具有的优点是使用已特别被证实本身在特定浓度下作为润湿剂或水结合剂的多元醇以预防干燥。依据特定的配置，该组合物包含有下列参数胶原蛋白[wt%]:大约50至70，酰胺氮[Wt%]:大约0.14至0.4，甘油[wt%]:大约12至35，脂肪[Wt%]:大约3至7，山梨醇[Wt%]:大约0至20，灰分[Wt%]:大约0.5至3，水[Wt%]:大约12至18，pH值大约5.5至8，每单位面积重量[,g/m2]:大约20至40，抗张强度[N/mm2]:大约5至25，或40至80。个别成分的浓度以使得更增进该组合物在培养生物细胞的适合性上的方式被进一步优化。为此目的，优选的是脂肪基本上是植物油。使用植物油来保存本发明的组合物已被证明是特别有利的。因为较高的弹性(elasticity)，植物油明显地扩大了该组合物应用的范围。使用植物油也可以防止酸败，因此有助于该组合物的制造与贮存。明确的是低微量的残余动物脂肪不会抵消植物油的优点。依据特别优选的配置，依据本发明的组合物的pH值是大约5.0至8.0，优选6.8至8.O，更优选大约7.0至8，最优选大约7.2至7.5。如同本发明人所发现的，在特定pH值下培养生物细胞特别地成功。因此，该组合物显示于生理区域中的pH值并且提供大体上类似于生物细胞的天然环境。例如由NaturinGmb服Co.KG商业提供的组合物通常具有大约4.8的pH值。在此酸性环境中，例如，培养对酸敏感的生物材料是不可能的。希望的pH值可以通过将该组合物培养在例如含钙或镁的磷酸盐缓冲液中而被调整，在此其他为本领域技术人员所熟知的常规缓冲液同样是适合的。对照此背景，本发明的另一目的涉及一种改善具有下列参数的组合物用于培养生物细胞的适合性的方法胶原蛋白[Wt%]酰胺氮[wt%]:多元醇[Wt%]:脂肪[wt%]:灰分[wt%]:水[wt%]:大约30至80，大约0.06至0.6，大约0至50，大约0至20，大约0至10，大约5至40，pH值大约3至10，每单位面积重量[g/m2]:大约10至100，抗张强度[N/mm2]:大约0.5至100，或20至100，其包括下列步骤(1)提供该组合物，以及(2)调整pH值至大约5.0至8.0，优选大约6.8至8.0，更优选大约7.0至7.8，最优选大约7.2至7.5。由于此"优化方法"，商业上可取得的薄膜(像是例如那些由NaturinGmb服Co.KG所提供的)显示明确改善的作为细胞培养载体的适合性。步骤(2)优选为在具有大约7.2至7.5的pH值的缓冲溶液中孵育该组合物。优化方法优选包括额外的步骤(3)，在该步骤期间该组合物与高度脂溶性的物质一起孵育。此措施具有的优点是，例如脂溶性物质通过使用100%丙酮提取。因此用于培养生物材料的组合物的质量可以被进一步地提高。此外，在依据本发明的优化方法过程中，优选的是步骤(3)包括步骤(3.l)，在该步骤期间该组合物于缓冲溶液中洗涤。在步骤(3.1)期间，剩余的高度脂溶性物质以及(若需要的括)其他污染残余物被移除以使得该膜备用或可以进一步加工或处理。优选地，依据本发明的优化方法还包含额外步骤(4)，在该步骤期间该组合物进行干燥。此措施具有的优点是它用于获得易于操作并且几乎可以被无限期地贮存的产物。依据优选的配置，依据本发明的组合物构造为平面薄膜(flatfilm)。由于此措施，该组合物以尤其适于细胞培养应用和在生物体内植入生物材料的形式被提供。依据本发明的组合物构造为可以被轻易切割或被压制成任何外型或尺寸的薄膜。对照此背景，该组合物优选地被构成分别作为供细胞培养应用的载体或基质或"支架"或作为用于生物材料植入生物体内的载体，优选干细胞和前驱细胞或特定组织细胞的植入。因为它的生物相容性以及它的附着支持性质，它可以被用于固定细胞。这在再生医学的领域中具有高度相关性，例如在用于韧带、腱、骨与软骨的细胞培养物的发育中。然而它也可以被用于其他组织。因此它还适用于用作伤口敷料。此外，该组合物可以被应用在例如化妆品领域中作为皮肤敷料。再者，因为胶原蛋白的化学组成，它特别适用于交联细胞效应成分，例如生长因子。7—个特别的优点是依据本发明的平面薄膜在干燥之后在无须任何额外协助的情况下附着至平坦的合成表面。结果，该薄膜(例如与细胞培养的塑料表面)产生无气泡的单元，其即使在低张力细胞培养期间也维持完整。因此，可以消除在细胞培养中影响细胞的胶合(gluing)和固定(affixing)辅助物。然而对于特定的应用来说，此连结可以使用机械工具(例如镊子)在不造成损伤的情况下解除且该薄膜可以连同生长其上的细胞一起从细胞培养盘移除。作为一替代方式，依据本发明的组合物构造成管形套(tubularcasing)。这个构型尤其适于用作供植入试验的细胞和物质贮器。在干燥的条件中，依据本发明的平面薄膜或管形套具有大约5至200ym的厚度，优选地10至100iim，更优选大约15至30iim，更优选大约20ym，以及最优选大约15ym。这个措施具有的优点是提供透明的并且可以在显微镜下被检验的特别薄的膜或套。在现有技术已知的以胶原蛋白为基础的细胞载体中并非如此。依据本发明，厚度在干燥条件中确定。术语"干燥的"在此处是等同于风干的以至于保持绝对残余湿度为大约为10%至15%。依据优选的进一步发展，该组合物是经辐射灭菌的，其优选地通过电离辐射的方式进行，或更优选通过P和/或Y辐射的方式进行。这个措施具有的优点是污染生物体被杀死并且待培养的生物材料的污染可以被广泛地避免。辐射灭菌法提供的优点是热敏感性胶原蛋白维持不受损坏。对照此背景，依据本发明的优化方法包含有额外的步骤(5)，其中发生化合物的辐射灭菌。再者，优选的是依据本发明的组合物还配备染料，优选荧光吸收染料。为了体外诊断的目的，该组合物可以被差异地染色。在处理过程中，荧光染色的细胞(其已透过薄膜)可以在有关药理学、生理学或细胞生物学测试的所谓渗透测试(penetrationtest)期间被建立，因为例如该组合物的荧光吸收色覆盖尚未渗透的荧光细胞。接着，只有渗透的细胞在荧光显微试验期间发光。本发明的另一主题是一种使用下列步骤培养生物材料的方法(1)提供适于用作生物材料的载体的组合物，(2)使该生物材料与该组合物接触，以及(3)在培养条件下孵育该组合物与该生物材料，其中，就本发明的应用所描述的上述组合物被用做为这里的组合物。本发明的另一主题涉及一种将生物材料植入生物体的方法，包含有下列步骤(1)提供适于用作生物材料的载体的组合物，(2)使该生物材料与该组合物接触，以及(3)将与该组合物接触的生物材料引入生物体内，其中，就本发明的应用所描述的上述组合物被用作这里的组合物。本发明的另一主题涉及依据本发明的组合物用于确定肿瘤细胞的侵入与转移潜力的用途。有关肿瘤细胞的侵入与转移潜力的常见体外试验方法是以下列原理为基础肿瘤细胞的渗透能力是通过穿孔和非降解的合成薄膜测量。在体外试验中，例如此系统作为测8量抗癌药品在细胞的渗透能力上的效用。然而肿瘤细胞的侵入性不只依赖于通过结缔组织间隙(孔)的移动能力，还有细胞酶促降解或重建结缔组织的成分(主要地由胶原蛋白构成)的能力。因为它的低厚度、同质性和标准化生产，生物胶原蛋白薄膜可以用于开发确定被培养的细胞的蛋白分解能力的药学测试系统。对于这个系统，细胞被培养在双室系统中。该两个室是使用胶原蛋白薄膜分开的。要被检验的细胞被培养在膜上的上室之中。在相应的培养期之后，移动通过胶原蛋白膜至膜的底侧上的细胞数目被定量。因此，使用依据本发明的组合物在体外诊断方面开启了一个新领域。依据本发明的组合物也可以被用来确定非肿瘤细胞的蛋白分解活性以及它们的侵入潜力，例如干细胞的活力试验。明确的是在不偏离本发明范畴的情况下，上述以及在下面所说明的特性不仅可应用在各自给定的组合中，而且可在其他组合中或在单独的方式中应用。本发明现将以具体实例为基础更为详细地进行说明，从这些实例中可以看出更多本发明的要件、优点以及特征。参照显示在下面的附图图1显示一6孔细胞培养板中的厚度为20iim的胶原蛋白嵌体(A)，作为供植入试验的细胞贮器的依据本发明的管形套(B、B')。图2显示在人类间质干细胞(hMSC)上的BrdU增殖分析的结果。BrdU-阳性细胞的免疫细胞化学分析。细胞被培养在常规的合成培养表面(A、A')上和在依据本发明的胶原蛋白基质上并且与BrdU—起孵育1小时。图3显示在人类间质干细胞(hMSC)上的BrdU增殖分析(A)和MTT测试(B)的结果，该细胞被培养在胶原蛋白基质和常规合成培养表面上。平均值连同各自的标准差被呈现。图4显示在成骨分化条件下矿质化胶原蛋白基质(与hMSC—起培养)的顶视图(A、A');来自脑纤毛带(cranialcalotte)的胚(E18)鼠成骨细胞在胶原蛋白基质培养2周之后的碱性磷酸酶活性(B、B')。图5显示通过在增殖条件下(A、A')和成骨分化条件(B、B')下与来自脑纤毛带的胚(E18)鼠成骨祖细胞一起培养的胶原蛋白基质的石蜡切片。图B和B'清楚显示三维基质的连续矿质化。整合和渗透能力取决于细胞类型。图6显示依据本发明的无细胞管形套植入C57/BL6鼠(A)以及在6周之后裸鼠中的植入基质(B)。图7显示恰在植入之前的依据本发明的管状薄膜(其与hMSC形成集落1天)(A)以及在6周之后长入结缔组织的外植植入物(B)。图8放大显示移植在C57/BL6鼠中6周之后的依据本发明的管形套。渗透于胶原蛋白薄膜的血管是清楚可辨的。图9显示在由外植的植入物形成的石蜡切片上的He染色。具体实施例方式1.含胶原蛋白的组合物发明人使用了7种商业上可取得的由NaturinGmbH&Co.KG所制造的薄膜并且发现它们适用于依据本发明的应用。所测试的商业上可取得的薄膜的参数被列在下面表1中表1.可由Naturin取得的基于胶原蛋白的薄膜的参数<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.1制造依据本发明的薄膜形式的组合物牛皮片作为用于制造薄膜形式的依据本发明的组合物的原料，其追溯性(traceability)以及卫生标准符合在第(EC)853/2004号规定中所指明的要求。这些牛皮片被粗略地机械预切并且在几个方法步骤中首先以水洗涤并且随后使用碱分解。分解的程度可以被改变并且取决于诸如处理的持续期间、碱性介质的浓度(PH值)以及温度的因素而定。石灰水、氢氧化钠溶液或这两种成分的混合物通常被用来建立碱性介质。然而，其他碱组合也可相同地适用。碱处理在例如12.5的pH值下进行并且时间可以从例如15小时至超过150小时，取决于希望的皮分解强度。酰胺氮被证明是用于分析追踪胶原组织的分解程度的可能参数分解越强，酰胺氮越少。在达到所欲的分解程度之后，酸被加入并且随后重复地用水漂洗。酸化通常是使用盐酸在6至10小时的期间完成，达到<2的pH值，优选地〈1。使用其他的酸也是可行的。PH值接着通过使用水的大量下游漂洗步骤从2.6增加到3.3。所形成的"胶原蛋白硬皮(callosities)"可以接着通过切碎并且通过具有渐小的孔径的穿孔盘将经切碎的材料压制成凝胶样的、粘弹性材料。1.1.l形成为平面薄膜(组合物号l)此"浓縮的"胶原蛋白块被转移至搅拌器，在该搅拌器中添加甘油、水和酸。同时，pH值被调整至优选地2.6-3.2并且干胶原蛋白的百分比被调整至1.6wt^与2.5wt^之间。该混合物接着通过均质机，被充气并且接着通过有槽喷嘴倾注到输送带上，在该输送带上所形成的凝胶薄膜通过隧道式干燥器。在进入干燥器之前，它优选地使用氨气予以蒸薰，因此升高凝胶的pH值。在干燥器的末端，经干燥的薄膜在它被盘绕起来之前通过再水化区。1.2形成管形套(组合物号2至7)来自1.1的粘弹性胶原蛋白块被转移至模制混合器中，在该混合物中甘油根据配方加入其中。pH值和干物质的百分比在水与酸被加入时同时进行调整。均质块接着通过环状有槽喷嘴而被挤出，由此形成无端点管形套。载气的同时注入保护管形套免于垮坍。吹制的管形套通过挤出管线的输送会详细地根据要被制造的肠的种类而被差异性地进行。原则上，有可能以不同顺序通过含有化学品的吹淋和干燥段。在挤出管线的末端，经干燥的管形套被平卧地摆放在橡皮辊(squeegee)之间并且在这个状态中巻绕于巻轴上。所得到的管状薄膜接着进行热处理，由此它们获得它们稍后的应用需要的机械稳定性。呈薄膜或管状形式的依据本发明的组合物也可以在其他胶原蛋白源的基础上制备，由此胶原蛋白凝胶的处理可能在它的细节上不同于先前的描述。基于猪皮胶原蛋白，例如，必须找出适当的方式以降低脂肪含量，其例如被描述在DE10060643以及EP1423016中。使用天然的肠来制备胶原蛋白物质是例如被描述在ES2017564中。这些文件被并入本说明书的公开内容中作为参考文献。1.2调整pH值pH值是通过使用含钙和镁的磷酸盐缓冲液(具有&++以及18++的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PAAH15-001))调整，该磷酸盐缓冲液将以胶原蛋白为基础的薄膜的pH值调整至pH7.2至pH7.5的生理区域内。为此目的，胶原蛋白薄膜通过搅拌的方式用缓冲系统洗涤5天。缓冲液1天更换2次。或者，胶原蛋白膜也可以被浸入pH值为7.3的含有磷酸盐缓冲液的甘油(磷酸盐缓冲液15.6g的KH2P04、71.3g的Na2HP04x2H20以及492.9g的甘油被溶解于7722g的蒸馏水中)中l小时。之后，经处理的薄膜放置排水并且置放在拉幅机(tenterframe)中，在那里它于室温下干燥过夜。1.3更多选择性处理在蒸馏水中短暂平衡之后，胶原蛋白膜以100%丙酮处理以提取脂溶性物质并且破坏水溶性蛋白质。在移除丙酮之后，经干燥的膜在负压下洗涤3次，每次1小时，各次使用含钙和镁的磷酸盐缓冲液(按g/1计:KC10.2;KH2P040.2;NaCl8.0;Na2HP04无水1.15;H15-001中的CaC12-2H200.132;H15-001中的MgC12-2H200.1)。为了清除缓冲盐，洗涤步骤被重复3次，每次1小时，各次在蒸馏水中。1.4干燥所取得的膜或薄膜被干燥。这可以在干燥箱中于6(TC下完成，由此可以达到<5%的湿度值(例如3%)。该膜也可以在室温下简单地通过让它在空气中干燥而被干燥，以至于它最终地根据膜或薄膜的平衡湿度来调整它本身至相对空气湿度(通常相当于介于大约8wt^至大约13wt^之间)。1.5成形与辐射灭菌所得到的经干燥的胶原蛋白膜或薄膜可以任何方式切割或冲压成例如DINA5片。这些片接着可以通过P或Y辐射的方式以25kGy或50kGy灭菌。胶原蛋白薄膜可以例如被制成为用于具有任何结构类型的合成加深杯(de印eningcups)例如微滴定板的插入物，或被制造成优选地具有<2mm，大约12mm至数厘米直径的无缝管形套。高热熔接或粘合该薄膜也是可行的。1.6所制造的薄膜形式的本发明组合物的参数不同平面胶原蛋白薄膜的参数被呈现在下面表2中，其是依据在1.1.1中描述的步骤达成的，由此依据1.3节中所述的步骤没有被施行。表2:所生成的以胶原蛋白为基础的薄膜的参数<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(*)对于从1至6的各个样品，有5个子试验没有灭菌(a)，P辐射25kGy(b)，13辐射50kGy(c)，Y辐射25kGy(d)以及Y辐射50kGy(e)施用了下列分析方法胶原蛋白在羟脯氨酸调节方面/酰胺氮类似物EP1676595(GeistlichS6hneAG)/甘油在HPLC方面/植物油通过索式提取(Soxhletextraction)/山梨醇在HPLC方面/在60(TC下马弗炉中5小时焚化之后的重量灰分/15(TC下干燥箱中干燥之后的重量水含量/通过使薄膜形成小片，将小片插入5XNaCl溶液中并且在10分钟之后使用玻璃电极测量的pH值/通过秤重具有平衡湿度的10cmx10cm薄膜片的每单位面积重量/于21。C空气调节后/冲压的样品体的60%相对湿度和100mm/min的横向速度通过UTS通用测试机(机型3/205，UTSTestsystemeGmbH)的纵向与横向的抗张强度。2.培养生物材料2.l组合物的配置图l显示依据本发明的具有20ym厚度的胶原蛋白薄膜，配置为用于细胞培养板的空腔(A)的插入物。管形套被显示在局部图(B)中，其被示意性地呈现在局部图(B')中。管形套以参考编号l显示。细胞以参考编号2显示，其可以被置放在套的内部。活性物质或生长因子以参考编号3显示，其亦可被置放在套中以影响生物细胞。2.2人类细胞的增殖行为相较于在塑料培养池中的常规培养步骤，人类细胞(间质干细胞MSC与人类细胞株SaOS2)在依据本发明的胶原蛋白薄膜上的增殖行为并未显示任何差异；图2。细胞被培养在常规的塑料培养表面(A)以及在依据本发明的胶原蛋白薄膜(B)上并且与BrdU孵育l小时。示意图(B')显示胶原蛋白薄膜在1处，细胞在2处，胶原蛋白纤维在5处以及BrdU-阳性细胞在6处。BrdU增殖分析(A)以及MTT生命力测试(B)的统计评估被呈现在图3中。之后，在依据本发明的胶原蛋白薄膜和常规塑料池之间没有显示显著差异性。2.3生物相容性来自脑纤毛带(cranialcalotte)的胚鼠祖细胞和hMSC在成骨分化条件下被培养在此基质上以评估依据本发明的胶原蛋白薄膜的生物相容性。结果被呈现在图4中。局部图(A)显示依据本发明的矿质化胶原蛋白基质的概观，其与hMSC—起在成骨分化条件下培养。局部图(B)显示在依据本发明的胶原蛋白箔(foil)上培养2周之后，来自脑纤毛带的胚鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性。局部示意图(A')和(B')显示胶原蛋白膜在1处，细胞在2a处以及细胞碱性磷酸酶活性的检测之后细胞在2b处。碱性磷酸酶活性和细胞诱导的矿质化的检测证明被培养细胞的分化潜力，并且因而证明依据本发明的基质的生物相容性。2.4培养三维组织结构石蜡切片从形成集落的胶原蛋白薄膜制得。对它们的矿质化进行组织化学分析。结果被呈现在图5中。局部图(A、A')显示在增殖条件下的石蜡切片，局部图(B、B')显示在成骨分化条件下。1意指胶原蛋白薄膜，2指细胞以及4指硝酸银沉积。这个实验一方面显示高矿质化潜力，以及另一方面细胞在三维薄膜/基质之中的整合能力。在依据本发明的这个基质协助之下，三维组织结构的培养是可行的。2.5植入植入实验在C57/BL6裸小鼠身上执行。为此目的，负载有细胞的依据本发明的管形套被植入到皮下组织与腹膜之间的区域。这个实验的结果被显示在图6中。局部图(A)显示植入以及局部图(B)显示在6周之后裸鼠中的依据本发明的被植入基质。拉长的箭头指向负载有细胞的依据本发明的管形套。在固定点的协助之下，具有被插入的非生物降解纤丝的管形套可以在局部图(B)中被简单地定位；虚线箭头。在局部图(B)中，制备物清楚地显示依据本发明的仍存在的管形套。图7局部图(A)显示恰在植入之前的依据本发明的管形套，其与hMSC形成集落1天。局部图(B)显示在6周之后生长在结缔组织中的外植的植入物。由此，十分清楚的是即使在植入之后6周，管形套的完整性得到维持，尽管有初始的吸收过程。植入物已清楚地生长在动物的结缔组织中并且被血管所横越；亦参见图8(A、A')。示意图(A')标示胶原蛋白膜(1)、细胞(2)、胶原蛋白纤维(5)以及血管(7)。HE-染色石蜡切片的免疫组织学分析显示已移入本发明的箔中的细胞；亦参见图9。血管可以在植入物(A，箭头)的区域中被清楚地建立。在示意图(A')中，l意指管形套，2指细胞，5指胶原蛋白纤维，7指血管以及8指结缔组织。3.结论本发明可以提供一种含胶原蛋白的组合物，例如呈薄膜或套形式，其可大规模制造且尤为适合用于培养以及产生生物材料。权利要求一种组合物用于培养生物细胞的用途，该组合物包含有下列参数胶原蛋白[wt％]大约30至80，酰胺氮[wt％]大约0.06至0.6，多元醇[wt％]大约0至50，脂肪[wt％]大约0至20，灰分[wt％]大约0至10，水[wt％]大约5至40，pH值大约3至10，每单位面积重量[g/m2]大约10至100，抗张强度[N/mm2]大约0.5至100。2.如权利要求1的用途，其特征在于该多元醇是选自于甘油[wt^]:大约0至50，和/或山梨醇[wt%]:大约5至40。3.如权利要求1或2的用途，其特征在于该组合物包含有下列参数胶原蛋白[wt%]酰胺氮[Wt%]:甘油[wt%]:脂肪[Wt%]:山梨醇[Wt%]:灰分[Wt%]:水[Wt%]:pH值每单位面积重量抗张强度[N/[g/m2]大约50至70，大约0.14至0.4，大约12至35，大约3至7，大约0至20，大约0.5至3，大约12至18，大约5.5至8，大约20至40，大约5至25。4.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该脂肪基本上是植物油。5.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于pH值是大约在5.0至8.O，优选地在6.8至8.0，更优选在大约7.0至7.8，最优选在7.2至7.5。6.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物被构造成平面薄膜。7.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物被构造成管形套。8.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物在干燥环境下具有大约为5至200iim的厚度。9.如权利要求8的用途，其特征在于该组合物在干燥环境下具有大约5至100iim，优选地大约10至30iim，最优选大约15iim的厚度。10.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物被构造成供细胞培养应用的载体。11.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物被构造成供植入至生物体内的生物材料的载体，所述生物材料优选为干前驱细胞。12.如前述权利要求中任一项的用途，其特征在于该组合物是通过辐射灭菌。13.如权利要求12的用途，其特征在于辐射灭菌是使用电离辐射进行。14.如权利要求13的用途，其特征在于该电离辐射是13和/或Y辐射。15.如前述权利要求任一项的用途，其特征在于该组合物含有染料，优选荧光吸收染料。16.—种组合物用以确定肿瘤细胞的侵入与转移潜力的用途，其特征在于所使用的该组合物是权利要求1至14项中任一项的用途的组合物。17.—种用于培养生物材料的方法，包含下列步骤(1)提供适于用作生物材料的载体的组合物，(2)使该生物材料与该组合物接触，以及(3)在培养条件下孵育该组合物和该生物材料，其特征在于所使用的该组合物是如权利要求1至15项中任一项的用途的组合物。18.—种用于将生物材料植入至生物体中的方法，包含有下列步骤(1)提供一适于用作生物材料的载体的组合物，(2)使该生物材料与该组合物接触，以及(3)将与该组合物接触的生物材料导入生物体内，其特征在于所使用的该组合物是权利要求1至15项中任一项的用途的组合物。19.一种增进组合物用于培养生物细胞的适合性的方法，该组合物含有下列参数胶原蛋白[wt%]:酰胺氮[wt%]:多元醇[wt%]:脂肪[Wt%]:灰分[wt%]:水[Wt%]:pH值每单位面积重量[g/m2]抗张强度[N/mm2]:该方法包含下列步骤大约30至80，大约0.06至0.6，大约0至50，大约0至20，大约0至10，大约5至40，大约3至10，大约10至100，大约0.5至100，(1)提供该组合物，以及(2)调整pH值在大约5.0至8.0，优选地大约6.8至8.0，优选地在大约7.0至7.8，最优选在大约7.2至7.5。20.如权利要求19的方法，其特征在于步骤(2)包含下列步骤(2.1)在pH值为大约7.2至7.5的缓冲溶液中孵育该组合物。21.如权利要求19或20的方法，其特征在于它包含下列额外步骤(3)将该组合物与高度脂溶性的物质一起孵育。22.如权利要求21的方法，其特征在于它包含下列额外步骤(3.1)于缓冲溶液中洗涤该组合物。23.如权利要求19或21中任一项的方法，其特征在于它包含下列额外步骤(4)干燥该组合物。24.如权利要求18或23中任一项的方法，其特征在于它包含下列额外步骤(5)将该组合物辐射灭菌。全文摘要本发明涉及含胶原蛋白的组合物用于培养生物细胞的用途、一种用于培养生物细胞的方法、一种用于植入生物材料至生物体中的方法以及一种用于增进组合物在供培养生物细胞的适合性方面的方法。文档编号C12N5/00GK101790581SQ200880103577公开日2010年7月28日申请日期2008年8月13日优先权日2007年8月20日发明者F·玛泽尔,L·尤斯特,T·施密特申请人:图宾根大学综合诊所