检测(顶部图像=对照，底部图像=SERF2-处理)。为了确定血细胞浓度，将检测的细胞数除以血管容量。
[0077]图18:采用TUNEL方法测定的鳃、骨骼肌和尾部的凋亡细胞。从这些实验中可以明显看出，SERF2-处理动物中不同区域的特异性污染细胞数低于未处理动物。
【具体实施方式】
[0078]实例1:材料&方法:
[0079]1.1 SERF2-克隆、表达和提纯
[0080]SERF2利用AB4cDNA文库采用菌落杂交方法鉴定。SERF2的编码序列是180bp，成熟蛋白质的长度是59个氨基酸，分子量是6899，pi 10.44。
[0081]SEQ ID NO 2:atgacccgcggtaaccagcgtgagctcgcccgccagaagaatatgaaaaag
[0082]SEQIDN0 1:MTRGNQRELARQKNMKK
[0083]cagagcgactcggttaagggaaagcgccgagatgacgggctttctgctgccgcccgcaagcag
[0084]QSDSVKGKRRDDGLSAAARKQ
[0085]agggactcggagatcatgcagcagaagcagaaaaaggcaaacgagaagaaggaggaacccaag
[0086]RDSEIMQQKQKKANEKKEEPK
[0087]标记
[0088]-
[0089]SERF2在5’ NcoI和3’ XhoI位点经密码子优化克隆到pET28载体(推断具有卡那霉素抗性)，不带标记。SERF2在BL21大肠杆菌中表达。
[0090]利用甘油储备液在选择性M9ZB培养基中制备隔夜预-培养基，并在37°C、220rpm摇动条件下培养。第二天，将隔夜预培养基稀释到0D_= 0.1，并在37°(:、220印111摇动条件下培养，直到0D_=0.5。然后，采用终浓度ImM的IPTG诱导蛋白质表达。然后，将培养基在30°C培养4小时，然后在室温、220rpm摇动条件下培养一个晚上。在2500g离心分离2小时收获细菌。
[0091]1.2SERF2 的提纯
[0092]为了裂解，将细胞在裂解缓冲液[75ml/l培养体积；50mM Na-磷酸pH 8，300mMNaCl,0, 2% Triton X-100]中重新悬浮，并在_80°C经历三次冻/融周期。第三次融化后，加入30ug/l DNAseI，将裂解的细胞在37°C培养30分钟。在2500g离心分离2小时收集上清液。
[0093]为了进行提纯，将过滤的溶解产物(0.22um)置于20mMTris pH8.0中，负载到SP-Sepharose 柱上(70ml CV)，流速为 14ml/min。米用 20mM Tris/IM NaCl pH 8.0，通过线性梯度洗脱组分，在214nm记录蛋白质。在通过银染色SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹法分别分离相关组分后，向最终30%的饱和溶液中缓慢加入硫酸铵，搅拌一个晚上。然后，将富盐SERF2 超滤(0.22um)，并通过 Hi Trap Octyl-Sepharose FF 柱(25ml CV)，流速米用 7ml/min进行第二次提纯。通过银染色SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹法鉴定相关组分(图1)，汇合和相对20mM Na-磷酸pH 7.4进行渗析。
[0094]1.3细胞培养
[0095]将大鼠胚胎心肌细胞H9c2 (ATTC CRL-1446)和胚胎骨骼肌细胞L6 (ATTCCRL-1458)在含10% v/v胎牛血清(FCS, PAA)和I % v/v盘尼西林/链霉素(Gibco)的Dulbecco's Modified Eagle Medium 高葡萄糖(DMEM, Sigma Aldrich)中培养。米用 15ml生长培养基，将细胞在80cm2细胞培养瓶(NUNC)中生长。两种细胞系均在+37°C和5% v/V CO2的增湿环境中培养。当融合度达到大约90%时，细胞分裂。通常采用的分裂比是1:5或1:10。为此，除去上清液，采用1ml Dulbecco’S磷酸盐缓冲盐水(DPBS, Gibco)洗涤细胞。加入3ml Tryp-sin/EDTA (Gibco)，然后在+37°C培养5-10分钟，收获细胞。加入7ml生长培养基，在显微镜aMT-2，Olympus)下检查细胞的成功分离情况。采用自动细胞分析仪(CEDEX，Innova-tis)，通过台盼蓝拒染法，测定细胞的数量和活力。为此，将950ul DPBS和50ul细胞悬浮液混合和用于分析。
[0096]原小鼠卫星细胞的分离:从雄性ICR小鼠采取肌肉组织，并用剪刀和小刀将其弄碎。在37°C在蛋白酶溶液(Sigma，St.Lois)中培养I小时后，通过移取和负载到Percoll (Pharmacia)梯度(75%、50%、30% )，分离剩下的组织块。在1250xg离心分离20分钟后，从第2分裂间期收集细胞(99%卫星细胞)，洗涤，并在6-孔板中按I X 15个细胞/ml 的细胞密度培养。亦参见 Danoviz ewt al.Methods Mol B1l.2012 ;798:21-52。
[0097]哺乳动物细胞的培养:
[0098]粘附细胞:A431是表皮样癌细胞，MCF-7细胞是上皮细胞，ECV-304源于膀胱癌。
[0099]悬浮细胞:TF_1细胞源于严重全血细胞减少症患者的骨髓。这些细胞需要以5ng/ml GM-CSF补充的培养基，并分化为巨噬细胞类细胞。Jurkat细胞系源于一名患急性T-细胞白血病(ATCC)的14岁男孩的血液。711-3是人类淋巴母细胞B-细胞系。
[0100]1.4 AlamarBlue?实验
[0101]按照生产商协议，利用AlamarBlue?实验测定增殖。简单地说，在每个含10ul生长培养基的孔内接种I X 14个细胞。将细胞在+37°C、5% v/v CO2和增湿环境中培养一个晚上。在开展分析之前，在显微镜下检查细胞的活力。通常细胞达到60%融合度。每个孔用10ul DPBS洗涤细胞三次。根据要求在DMEM中稀释肽(50ng/ml-20ug/ml)，将其按10ul/孔加入到细胞中。最后，根据实验类型，将细胞在+37°C培养不同的时间点。然后，按1ul/孔加入AlamarBlue?试剂(Invitrogen)。将培养板在+37°C培养I小时。采用Var1skan Flash 多-板读数仪(Thermo Scientific)测定焚光(Ex.570nm, Em.585nm)。米用Microsoft Excel和Graph Pad Prism V4对得到的数据进行评估。
[0102]1.5鸡胚-绒毛尿囊膜实验(HET-CAM)
[0103]受精特异性-无病原体蛋是由BAXTER B1sciences (奥地利维也纳)提供的胎龄5天的蛋(白来航鸡)。采用浸泡MicrozicK奥地利Schiilke)的毛巾对鸡蛋表面进行消毒。钻一个小孔，利用带18G针头的注射器抽取3ml蛋白。然后，用石蜡将孔封住。在顶部另外钻一个孔用于打开鸡蛋。用镊子除去此部分的蛋壳。除去下面的膜，从而可以接近绒毛尿囊膜(CAM)。最后，用消毒铝箔封住这个操作窗口。将鸡蛋在+37°C、5% v/v CO2和增湿环境中培养。在胎龄6天(E6)时，用70% v/v乙醇洗涤塑料片三次(外径12mm，内径3mm)，用消毒 Locke (0，15M NaCl, 5mM KCl, 2mM CaC12, 2mM NaHCO3)缓冲液洗涤三次。最后，将塑料片盖在CAM上。将选择的肽稀释，移取到塑料片的中间，施用到E6CAM上。将蛋在+37°C培养，直到ES或Ell，这取决于实验类型。利用配备数码相机(日本尼康CoolpiX990)的立体显微镜(德国Zeiss的StemiSVll)在规定时间点给CAM拍照。在实验结束后，采用显微镜对试验肽的血管生成潜力进行评估。
[0104]1.6染色方法
[0105]台盼蓝染色是利用光学显微镜确定细胞活力的最常用的方法之一。台盼蓝只会使膜破损的细胞染色。活的细胞不吸收染料。
[0106]1.7 Caspase 3 -特异性 ELISA
[0107]Caspase-3是半胱氨酸天冬氨酸-特异性蛋白酶家族的成员，是细胞凋亡早期事件的标志物。采用商业试剂盒测定Caspase-3表达。简单地说，收获采用不同处理方法后经历凋亡的细胞的培养上清液，并用以P-硝基苯胺(pNA)标记的底物培养，当P-硝基苯胺被caspase-3裂解时，产生黄色。产生黄色的数量与caspase-3活性成比例，活性可通过ELISA读数仪在405nm测定(Promega)。该实验基本上按照生产商(CaspACE? Assay System使用说明书，Pr omega)所述开展。
[0108]实例2:结果
[0109]对重组SERF2蛋白质进行克隆并采用与浆细胞样树突状细胞类似的人细胞系表达。结果表明，SERF2刺激大鼠肌细胞增殖和促进血管形成。因此，显然，SERF2影响各种人细胞。第一个实验用于探索SERF2是否能够刺激肌细胞和卫星细胞增殖。
[0110]2.1 SERF2支持骨骼肌细胞、心肌细胞和原卫星细胞增殖
[0111]这些实验的目的是测定SERF2对大鼠胚胎心肌细胞系H9c2的增殖影响。按照方法部分所述处理24小时和开展AlamarBlue?实验。得到的结果如图3所示。采用小鼠卫星细胞MuMa23/Pl开展一组类似的实验。得到的结果如图4所示。在这两组实验中，采用人SERF2进行的处理得到剂量-依赖的增殖效果。这一结果与采用L6大鼠骨骼肌细胞实验的结果类似(图2)。在这些实验中，这两个细胞系(L6和H9c29)均采用SERF2处理一次。每天开展一次AlamarBlue?实验，直到培养的第6天。实验的结果分别如图5和图6所示。
[0112]SERF2对L6大鼠骨骼肌细胞具有剂量-依赖和时间_