依赖的增殖效果。在培养3至6天后观察到最大效果。采用SERF2处理心肌细胞(H9c2)得到了类似的结果。在5ug/ml SERF2时观察到增殖效果峰值。
[0113]2.2鸡胚绒毛尿囊膜实验中SERF2的血管生成影响
[0114]HET-CAM实验可以评估底物或细胞的血管生成潜力。确定合适的VEGF浓度，VEGF可用于阳性对照。为此，将VEGF-A向两个鸡蛋的CAM上施用一次(100ng/CAM abs.)。两个鸡蛋不进行处理，用作阴性对照。处理在胎龄第6天(E6)进行。采用光学显微镜在Ell测定血管生成响应。此实验的照片如图12所示。
[0115]为了对SERF2的促血管生成性质进行评估，对蛋白质开展Het-CAM实验。每个CAM施用3ug PBS和SERF2肽。采用VEGF-A (0.5ug/CAM)作为阳性对照，PBS作为阴性对照。在胎龄第6天和第7天开展处理。期间所有稀释溶液均在+4°C储存，并在施用前允许在室温平衡。采用显微镜在E7和ES对血管生成响应进行评估。每次处理均平行开展三次。这两天所拍照片用于记录(参见图12)。正如手动计数新形成血管数量测定的那样，在Het-CAM实验中，SERF2具有促-血管生成响应。
[0116]2.3 SERF2预防人细胞凋亡
[0117]需要了解的是SERF2对生长因子剥夺-或应激诱导细胞凋亡是否有影响。实验协议包括加入过氧化氢(H2O2)，已知在200uM以下剂量时，过氧化氢会造成细胞应激，最终造成细胞凋亡(Cox A.，Carcinogenesis.2007，Vol.28，10)。此外，通过剥夺TF-1细胞培养基中粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，诱导细胞凋亡。这些细胞依赖于是否存在对于TF-1细胞生长和分化来说绝对必要的生长因子。
[0118]结果如图7 (A431细胞-H2O2实验)、图8 (MCF-7细胞-H 202实验)、图9 (Jurkat细胞-H2O2实验)、图10(TF-1细胞-生长因子实验)和图11 (711-3细胞-H2O2实验)所示。
[0119]在所有实验设计中，细胞培养基中SERF2的存在显著减少了细胞凋亡。值得指出的是，各种来源的细胞，如上皮细胞或骨髓细胞或淋巴系细胞都可以看到这种效果。
[0120]2.4.SERF2对斑马鱼的体内影响
[0121 ] 斑马鱼是研究脊椎动物发育、生理学和人类疾病的重要模型。与哺乳动物相比，关于循环系统，斑马鱼不仅具有控制血细胞生成、血管生成和血管发生的高度保守的路径，而且，其所有主要血细胞类型与它们相同。因此，斑马鱼是非常好的研究脊椎动物心血管发育的模型有机体。大型正向遗传学筛选已经鉴定了许多斑马突变体，这些突变体用于建立遗传血液病、恶性血液疾病、发育血液学，以及心脏发育和心脏功能改变的模型。斑马鱼模型的另一个优点是其在发育的第一个10天期间向胚胎简单扩散供氧。因此，在此期间，胚胎能够存活和发育，没有心跳或循环血液，从而方便对循环系统进行发育研究。
[0122]鉴于其幼体尺寸小，过去十年内建立了几种方法来计算心血管表现、血管生成过程、肌肉功能和运动神经元完整性。我们采用两种施用路径，将斑马鱼用于SERF2的体内表征:1)将天然蛋白质注射到受精3天后(dpf)的动物的卵黄囊内或2)采用扩散供应的天然蛋白质慢性孵化。这两种施用路径的蛋白质有效吸收，允许研究其对心肌生长、血管形成和细胞凋亡的影响。
[0123]方法。SERF2通过以下方法施用:a)将不同浓度的天然蛋白质注射到受精3天后(dpf)的动物的卵黄囊内和刚受精的卵(2-8个细胞阶段)内，或采用扩散供应的天然蛋白质慢性孵化。为了对血管生成影响进行深度分析，采用内皮用gfp(绿色荧光蛋白)标记的flk-1转基因动物。对于其它所有实验，采用野生型(wdt)动物。
[0124]正如 Schwerte et al (Schwerte et al.The Journal of ExperimentalB1logy.2003 ；206 (Pt8): 1299-1307)所述，通过测量舒张末期尺寸和计算舒张末期容积来确定心脏尺寸。
[0125]血管形成指数。如前文所述(Schwerte等，上文)，通过积累后面多张区别图片移动红细胞的移动载体，得到血管床的铸型。与此同时，给显示绿色荧光内皮的fik-1转基因动物拍照。
[0126]凋亡细胞原位染色TUNEL实验。采用原位细胞死亡检测试剂盒、荧光素(德国曼海姆Roche Applied Science)，按照生产商说明，用TUNEL方法检测凋亡细胞。统计分析。采用双尾学生t-试验(Microsoft Excel)对得到的数据进行统计学分析，当P〈0.05时，显著性可以接受。数据以平均值土S.E.M表示。
[0127]结论。采用SERF2处理斑马鱼，导致该动物的心脏容积显著增加(参见图13a&13b)。其中一个最重要的发现是血细胞浓度高，与对照相比，显著增加50至100% (图14)。应该谨记的是，从前面的研究中可以知道，这一参数对需要提高氧输送的生理状况更敏感，与已经显示的相比，它可能指示了斑马鱼发育后期血管生长增加(Schwerte等，上文)。在脊椎动物中，血管和血细胞具有共同的干细胞，即成血管细胞。从文献中可以了解到(Schwerte等，上文)，在新的血管形成之前，对缺氧的第一响应是血细胞浓度增加。从生理学观点来看，因为总携氧能力增加，与新发育的血管相比，响应更快，反过来填充新的血液和血细胞。血细胞浓度是调节携氧能力的中心参数。以前的研究表明，与血管生长相比，这一参数对要求输氧增加的生理学状态更敏感。在7dpf时，除一个处理组之外，其它组均显示血细胞浓度显著增加。在所有药物输送路径中都发现存在这种增加，证明了 SERF2可以通过皮肤培养和吸收输送及通过肠道注射和吸收输送(图15-17)。SERF2处理的动物凋亡细胞数减少，表明了 SERF2明显的体内抗凋亡影响(图18)。
【主权项】
1.作为药物使用的SERF2、编码所述SERF2的核酸或表达SERF2的细胞。2.用于治疗或预防萎缩病或萎缩症或用于细胞再生治疗的SERF2、编码所述SERF2的核酸或表达SERF2的细胞。3.根据权利要求2所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中所述萎缩与细胞凋亡增加或细胞再生减少有关。4.根据权利要求2或3所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中所述萎缩是细胞减少，细胞选自肌细胞，特别是心肌细胞或骨骼肌细胞或平滑肌细胞，结缔组织细胞，特别是肌肉周围的结缔组织细胞，上皮细胞，特别是血管细胞，及卫星细胞，或骨细胞。5.根据权利要求2-4中任意一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中所述疾病或症状选自肌少症、恶病质、营养不良(特别是肌营养不良)、发育不全、张力减退(特别是手术后张力减退)、多肌炎、纤维肌痛、肌管性肌病、肌肉系统代谢病、帕金森病、重症肌无力、心肌病、心肌细胞收缩障碍、皮肤老化或者本发明的治疗方法是用于预防外科手术铸型或任何其它固定不动或它们的组合实施一段时间后的肌肉损失或肌肉萎缩。6.根据权利要求1至5任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中向患者施用SERF2。7.根据权利要求1至6任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中用SERF2间接体内处理患者的细胞，向所述患者施用所述细胞。8.根据权利要求7所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中向所述患者施用干细胞或祖细胞。9.根据权利要求2至8任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞，其中所述疾病或症状是慢性或急性疾病或症状。10.一种提高干细胞、祖细胞、上皮细胞(特别是表皮细胞)、间充质细胞(特别是心肌细胞)、卫星细胞、骨骼肌细胞、造血细胞(特别是造血干细胞或祖细胞)增殖的体外方法，或降低所述细胞凋亡率的体外方法，包括向所述细胞施用SERF2或编码SERF2的核酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞选自肌细胞，特别是心肌细胞或骨骼肌细胞或平滑肌细胞，结缔组织细胞，特别是肌肉周围的结缔组织细胞，及干细胞，祖细胞，特别是卫星细胞，造血细胞，骨骼肌细胞，上皮细胞，特别是表皮细胞或骨细胞。12.根据权利要求1至11任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞或方法，其中SERF2包括SEQ ID NO:1中提出的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1中提出的氨基酸序列组成，或包括与SEQ ID NO:1提出的序列具有至少70%序列一致性的氨基酸序列或由与SEQ IDNO:1提出的序列具有至少70%序列一致性的氨基酸序列组成。13.根据权利要求1至12任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞或方法，其中SERF2 的施用浓度是 0.5ug/ml 至 1000ug/ml，优选 lug/ml 至 800ug/ml，特别优选 2.5ug/ml至 500ug/ml，甚至更优选 4ug/ml 至 300ug/ml，最优选 5ug/ml 至 100ug/ml。14.根据权利要求1至13任一项所述的供使用的SERF2、核酸或细胞或方法，其中处理经历氧化应激的细胞。15.包括SERF2或编码SERF2的核酸和药学上可以接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂与/或佐剂的药物组合物。
【专利摘要】本发明提供作为药物使用的SERF2、编码所述SERF2的核酸或表达SERF2的细胞，特别是用于治疗或预防萎缩病或萎缩症或用于增加肌少症、恶病质、营养不良、发育不全、张力减退或肌肉损失患者的细胞生长，以及提供适合细胞培养增殖的体外方法和药物组合物。
【IPC分类】A61K31/00, C07K14/435
【公开号】CN105163726
【申请号】CN201380072269
【发明人】R·贝格尔
【申请人】西穆贸易咨询及租赁有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2013年12月13日
【公告号】CA2895131A1, EP2742935A1, EP2931264A1, US20150307568, WO2014090991A1