脂质纳米颗粒组合物以及制备和使用其的方法
【专利说明】脂质纳米颗粒组合物从及制备和使用其的方法
[oow] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年5月23日提交的美国临时申请61/650, 729和2013年3月14 日提交的美国临时申请61/784, 892(将所述临时申请的公开内容通过引用整体并入本文） 的优先权。
[0003] 关于联邦政府资助的研究的声明
[0004] 本发明是在国立卫生研究院授予的基金号R01CA135243、DK088076和CA152969下 由政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。 阳00引序列表
[0006] 本申请包含已通过EFS-web提交并且通过引用整体并入本文的序列表。于2013 年5月22日创建的ASCn副本被命名为604_54848_WQ_LIST_0SU-2013-246.txt，大小为 3, 490字节。
技术领域
[0007] 本公开内容设及可用于递送治疗性组合物包括但不限于核酸（NA)的脂质纳米颗 粒（LN)。 阳00引发明背景
[0009] 脂质体是由一个或多个脂双层组成的小囊泡，其能够运载亲水性分子（在含水核 屯、内）或疏水性分子（在其脂双层中）。如本文中所用，"脂质纳米颗粒"（LN)为描述亚微 米范围内的基于脂质的颗粒的一般术语。LN可具有脂质体的结构特征和/或具有可选择的 非双层类型的结构。利用LN通过全身性途径进行的药物递送需要克服几个生理屏障。网 状内皮系统（RE巧负责从循环清除LN。一旦逸出脉管系统并到达祀细胞，LN通常通过胞吞 作用被吸收，并且必须在酸性内涵体条件中的降解之前将药物释放至细胞质中。
[0010] 特别地，运样的核酸（NA)(包括siRNA和其它治疗性寡核巧酸）的递送是限制它 们用于临床转换（clinicaltranslation)的潜力的主要技术挑战。
[0011] 高效递送媒介物的开发是寡核巧酸（〇脚治疗剂的临床转换的关键。期望LN制剂 应当能够（1)保护药物免受酶促降解；（2)横穿毛细血管内皮；(3)特异性到达祀细胞类型 而不引起过度免疫活化或脱祀细胞毒性；(4)促进胞吞作用和内涵体释放；和（5)形成具有 胶体稳定性和长胆存期的稳定制剂。 阳〇1引发明概述
[0013] 本文中提供了可高效率封装治疗性寡核巧酸并且达到有效递送的物理和生 物学标准的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有叔胺和季胺头基的 阳离子脂质的组合。在某些实施方案中，除了脂质W外，脂质纳米颗粒还包含小肤例如短杆 菌肤。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含RNA酶或DNA酶降解试剂例如蛋白酶K。还 提供了运些实施方案的组合。季胺和叔胺-阳离子脂质的组合（QTsome)、短杆菌肤（A、B、 C或D) (SPLN-G)和/或蛋白酶K化Ksome)的渗入增加了脂质纳米颗粒制剂的转染率。
[0014] 在第一广泛方面，本文中提供了包含叔胺和季胺-阳离子脂质的组合的脂质纳米 颗粒。在某些实施方案中，叔胺-阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DC-CHOレN，N-二甲基十六 烷基胺或其组合。在某些实施方案中，季胺-阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DDAB或其组 合。在某些实施方案中，叔胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的50.0摩尔百分率。在 某些实施方案中，季胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的20. 0摩尔百分率。在特定实 施方案中，脂质纳米颗粒W选自45:0、5:40、15:30、22. 5:22. 5、30:15或40:5的摩尔比包含 脂质DODMA和DOTMA。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒W选自90:10、70:30、50:50、30:70 或10:90的摩尔比包含脂质DMHDA和DOTAP。
[0015] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物 质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。在某些实施方案中，封装的分 子包括选自质粒DNA、反义寡核巧酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。在某 些实施方案中，治疗剂或核巧酸的封装率为20 %或更高。
[0016] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含阳离子聚合物。在具体的实施方案中，阳 离子聚合物选自：精胺、赃嗦、S精胺、四精胺、寡精胺、thermine、精脉、二精脉、S精脉、寡 精脉、腐胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、分枝或直链类型的聚乙締亚胺和聚締丙胺。
[0017] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含融合肤。
[0018] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒具有小于300nm的直径。
[0019] 在另一个广泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直径并且包含肤的脂质 纳米颗粒。在某些实施方案中，肤选自短杆菌肤A、B、C、D或S;JTS-1 ;蛋白酶K(PrK); trichorovin-Xlla;狂犬病病毒糖蛋白；白细胞介素-1P;HIV-化t;单纯瘤疹病毒VP22蛋 白；及其组合。在某些实施方案中，肤包括抗生素。在特定实施方案中，抗生素选自短杆菌 肤A、B、C、D或S。在特定实施方案中，肤基本上由脂质化（lipidated)JTS-l融合肤组成。 在特定实施方案中，脂质化（lapidated)JTS-1融合肤W总制剂的约0至约30摩尔百分率 存在。
[0020] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含蛋白酶K。蛋白酶K可总制剂的约0 至约30摩尔百分率存在。
[0021] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物 质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。在某些实施方案中，封装的分 子包括选自质粒DNA、反义寡核巧酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。
[0022] 在另一个广泛的方面本文中提供了包含DM酶或RNA酶降解试剂的脂质纳米颗 粒。在某些实施方案中，DNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组成。在某些实施方 案中，纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、 生物标志物或其组合的分子。在具体实施方案中，封装的分子包括选自pDNA、反义寡核巧 酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的寡核巧酸。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒 具有小于300nm的直径。
[0023] 在另一个广泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直径并且包含如下物质的 两种或更多种的组合的脂质纳米颗粒：叔胺和季胺-阳离子头基的混合物；抗生素；和DNA 酶或RNA酶降解试剂。在某些实施方案中，DNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组 成。在某些实施方案中，抗生素包括短杆菌肤A、B、C、D或S。
[0024] 本文中描述的脂质纳米颗粒制剂的任何制剂可包含聚乙二醇-脂质缀合物。在某 些实施方案中，聚乙二醇-脂质缀合物选自聚山梨醋80、TPGS、mPEG-DSPE、阳G-DMG。在某 些实施方案中，聚乙二醇-脂质W低于约10.0摩尔百分率的浓度存在。在某些实施方案中， 脂质纳米颗粒还包含N，N-二甲基十六烷基胺。在具体实施方案中，N，N-二甲基十六烷基 胺W低于制剂的约60. 0摩尔百分率的浓度存在。
[00巧]在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含能够结合祀细胞或祀分子的配体。在某 些实施方案中，配体为抗体或抗体片段。在具体实施方案中，配体选自cRGD、含半乳糖部分、 转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白或表皮生长因子。
[00%] 在另一个广泛的方面本文中提供了包含本文中描述的脂质纳米颗粒和药学上可 接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤施用 药物组合物。在某些实施方案中，将药物组合物制备为口服施用片剂、无菌溶液、无菌悬浮 液、冻干粉剂或栓剂。
[0027] 在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断或治疗癌症或传染病的方法。方法包括 给有此需要的患者施用有效量的本文中描述的药物组合物。
[0028] 附图概述
[0029] 图1 :SK-HEP-1细胞中蛋光素酶表达的下调。用通过LN递送的蛋光素酶特异 性siRNA处理表达蛋光素酶的细胞，所述LN包含数种不同的叔胺值0DMA，DMA)和季胺 值0TMA，TMA)的组合（QTsome)。将Lipofectamine2000 化ipo2000)用作阳性对照。蛋光 素酶活性表达为相对于未处理的细胞的百分数。
[0030] 图2 :QTsome中的G3139对邸细胞中的Bcl-2表达的下调。评价了包含不同量 的DMHDA的QTsome。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的 Bcl-2mRNA表达，其中未处理的邸细胞用作mRNA表达的基线。 阳的1] 图3 :W15:1的N:P凝聚了c-myb的SPLN-G的C电位。
[0032] 图4 :在0%和20%的血清条件下用SPLN-G处理的SK-HEP-1细胞的活力。细胞 活力表达为相对于未处理的SK-HEP-1细胞的平均活力的百分数。
[0033] 图5 :使用SPLN-G递送的蛋光素酶-SiRNA对SK-HEP-1细胞中的蛋光素酶表达的 下调。将Lipofectamine2000化ipo2000)用作阳性对照。蛋光素酶活性表达为相对于未 处理的细胞的百分数。 W34] 图6 :使用加载有G3139 (针对Bcl-2的AS0)的SPLN-G对MCF-7细胞中的Bd-2 表达的下调。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的Bcl-2mRNA表达，其中未处理的MCF-7细胞用作mRNA表达的基线。
[0035] 图7 :使用加载有G3139 (针对Bcl-2的AS0)的SPLN-G对邸细胞中Bcl-2表达的 下调。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的Bd-2mRNA表达， 其中未处理的邸细胞用作mRNA表达的基线。
[0036] 图8:乳糖化对SPLN-G尺寸和C电位的影响。运些通过无唾液酸糖蛋白受体 (ASGR)祀向肝和肝癌细胞。
[0037] 图9 :通过蛋光素酶测定在表达蛋光素酶的SK-HEP-1细胞中评价无唾液酸糖蛋白 受体（ASGR)祀向和SPLN-G中的短杆菌肤。蛋光素酶活性表达为相对于未处理的细胞的百 分数。
[0038] 图10 :通过共聚焦显微镜观察的SPLN-G的细胞转运。DAPI(蓝色）用于对细胞的 细胞核染色。siRNA-切3(红色）用于跟踪siRNA的内化。叠加显示高百分数的siRNA被递 送至胞质溶胶。 W39] 图11 :通过流式细胞术观察的封装切3-siRNA的非祀向SPLN-G和乳糖化 SPLN-G(Lac-SPLN-G)的细胞吸收。
[0040] 图 12 :Lac-SPLN-G-anti-miR-155 对SK-肥P-1 细胞中的miR-155 的下调。无序 对照（scrambledcontrol)miRNA(SC)用作阴性对照。通过RT-PCR测定相对于RNU她的 miR-155表达，其中未处理的SK-HEP-1细胞用作mRNA表达的基线。
[0041] 图13 :不同的脂质-对-siRNA(w/w)比率的Lac-SPLN-G-siRNA复合物的凝胶迁 移率变动分析。
[0042] 图14 :使用具有L0R-1284 (祀向核糖核巧酸还原酶RNRR2亚单位的SiRNA)(购 自化armacon)的PrKsome对邸细胞中的RNRR2表达的下调。通过qRT-PCR测定相对于 肌动蛋白的RNRR2mRNA表达，其中未处理的邸细胞用作mRNA表达的基线。
[0043] 图15A-B:不同血清条件下阳'Ksome对RNRR2表达水平的下调。图15A显不无血 清；图15B显示5%FBS。图15C显示10%FBS。通过实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白的 RNRR2mRNA表达，其中未处理的邸细胞用作mRNA表达的基线。 W44] 图16 :具有和不具有P巧的脂质纳米颗粒的细胞活力比较研究。细胞活力表达为 相对于未处理的KB细胞的平均活力的百分数。
[0045] 图17 :L0R-1284siRNA在血浆中的稳定性研究。在72小时的时期内在小鼠血浆中 溫育阳'Ksome制齐Ij，通过凝胶电泳显现剩余的siRNA的相对量。
[0046] 图18 :包含1:0. 3的siRNA:Pri((w/w)的hKsome的溫度依赖性C电位。
[0047] 图19 :通过10%FBS培养基中的hKsome递送的L0R-1284siRNA对RNRR2下调 的溫度依赖性效率。通过实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白的RNRR2mRNA表达，其中未处 理的邸细胞用作mRNA表达的基线。
[0048] 图20 :QTsome的作用机制。
[0049]图 21 :SPLN-G的描述。
[0050] 图22 :蛋白酶K包衣保护寡核巧酸免受存在于血清中的DNA酶和RNA酶降解。
[0051] 图23 :具有JTS-1融合肤的SPLN-J和具有蛋白酶K包衣的LN的简图。
[0052]图 24 :加载有anti-miR-221 的SPLN-G20 在MDA-MB-468 乳腺癌细胞中对p27/ kiplmRNA的上调。运显示SPLN-G20是用于递送anti-miR的有效媒介物。P27/Kipl是 miR-221的祀。该上调表明miR-221功能的抑制。
[0053]图 25 :BT-549 细胞的p27/Kipl中的SPLN-G20 转染。
[0054]图26 :BT-549细胞的邸a中的SPLN-G20转染。 阳化5] 图27 :Lac-D0PE(蓝色）、DOPE(红色）和乳糖醒酸（绿色）的FTIR光谱。 W56] 图28A-B:Lac-GLN的表征：图28A显示具有不同程度的乳糖化的GLN的粒 度和C电位。每一个值代表5个测量的平均值+SD。图28B显示通过TEM显示的 anti-miR-155-Lac-GLN的形态学。比例尺代表lOOnm。
[0057]图29A-29B:Lac-GLN的表征：图29A)Lac-GLB的胶体稳定性。将Lac-GLN-anti-miR-155于4°C或25°C胆存，随时间过去测量粒度。结果为3个单独实验 的平均值。误差棒代表标准差。图29B)anti-miR-155-Lac-GLN的血清稳定性。将单独的 anti-miR-155 或anti-miR-155-Lac-GLN与 50%FBS在 37°C混合 0虹、4虹和 12虹。随后 利用凝胶电泳分析样品。 阳化引 图30 :包含anti-miR-155的化N和Lac-GLN的物理化学性质。值为平均值±SD(n=5)。
[0059] 图31 :包含切3-anti-miR-155的Lac-GLN和其它对照制剂在化pG2细胞中的细 胞吸收，如通过共聚焦显微镜测定的。
[0060] 图32A-C:用GLN、Lac-GLN或利用20mM乳糖和1 %BSA预溫育的Lac-GLN处理 化pG2细胞。在FACS化libur流式细胞仪上测量巧光信号。图32A显示利用GLN或Lac-GLN 处理化pG2细胞。图32B和图32C分别显示利用20mM乳糖和1 %BSA的预溫育对Lac-GLN 的影响。结果示于直方图中，X和Y轴分别表示巧光强度和细胞计数。
[0061] 图33A-33C:Lac-GLN和其它制剂的体外递送。图33A)包含Luci-siRNA的Lac-GLN 和其它对照制剂的体外递送。用包含lOOnM的浓度的luci-siRNA的Lac-GLN转染SK-肥P-1 细胞，进行4虹，转染后48虹评价蛋光素酶基因表达。结果为4个重复的平均值。误差棒代表 标准差。图33B)来自MTS分析的Lac-GLN的细胞毒性。结果代表平均值+SD。图33C)包 含anti-miR-155的Lac-GLN和对照制剂的体外递送。用包含lOOnM的浓度的anti-miR-155 的Lac-GLN转染化pG2细胞，转染后48虹评价miR-155表达。结果为3个重复的平均值。 误差棒代表标准差。 W62] 图34A-B:不同浓度的anti-miR-155处理对miR-155和祀基因表达的体外评价。 图34A显示不同浓度的anti-miR-155处理对miR-155表达的评价。用包含lOOnM或200nM anti-miR-155 的Lipofectamine2000 和Lac-GLN转染HepG2 细胞，进行 4虹，转染后 48虹评 价miR-155表达。值代表平均值±SD(n= 3)。图34B显示miR-155祀向基因表达的评价。 在用阳性对照或包含lOOnM和200nManti-miR-155的Lac-GLN转染化pG2细胞后48虹，评 价C/EBPP和F0XP3基因表达。结果为3个重复的平均值。误差棒代表标准差。 W63] 图35A-35B:包含切5-anti-miR-155的化N和Lac-GLN的组织分布。在包含 切5-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的静脉内施用后4虹，从C57BL/6小鼠收集屯、脏、肺、 脾、肾和肝。通过IVIS成像系统测量切5巧光信号。
[0064]图36A和36B:包含切3-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN在肝和其它器官中的共 聚焦显微镜检查。图36A显示在包含切3-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的静脉内施用 后4虹，从巧7B1/6小鼠收集肝、肺和脾。在OlympusFVlOOOFilter共聚焦显微镜上显现 切e3巧光信号。在图36A中，红色和黄色箭头分别表示切4-anti-miR-155被肝细胞和枯否 细胞吸收。 W65] 图37A-C:anti-miR-155处理对miR-155和祀基因表达的体内评价。用包含 1. 5mg/kganti-miR-1