远程装载略微水溶性药物至脂质体的制作方法

远程装载略微水溶性药物至脂质体的制作方法
【专利说明】远程装载略微水溶性药物至脂质体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2013年2月1日提交的美国临时专利申请号 61/759, 914的优先权，为了所有的目的通过引用W其整体并入本文。
[000引发明背景
[0004] 本发明设及药学组合物、制备它们的方法和所得组合物在药物治疗中的用途的领 域。药学组合物包括封装在脂质体膜泡的水性内部内的活性治疗剂。
[0005] 相关技术描述
[0006] 制药工业，在其寻找改善的药物时，已经产生了许多有力的化合物，其略微可溶于 使得可能有生命的无处不在的溶剂水中。运些新药物的低水溶解度已经使得其难W在包括 人的动物中递送它们。运已经需要可溶解略微水溶性药物W确保能够在身体中递送它们的 药物递送系统。
[0007] 脂质体是膜泡结构，通常由捕获水性核屯、的双层膜的两性分子比如憐脂组 成。各种类型的脂质体的直径和形态图解在图1中。药物封装在水性核屯、中或交错在 双层膜中。当在身体中稀释时，膜中交错的药物转移离开脂质体。重要地，封装在水 性核屯、或在水性核屯、中W复合物保持的药物明显比双层中的药物保持更长。充分阐 释了药物封装在水性核屯、中的脂质体用于药物递送的应用化化ummond等，J.化arm. Sci., (2008)97(11):4696-4740,PMID10581328)〇
[0008] 可使用用于在脂质体中封装功能化合物，尤其药物的各种装载方法。例如，亲水化 合物可通过水化功能化合物和形成膜泡的脂质的混合物封装在脂质体中。该技术称为被动 装载。随着纳米颗粒形成，功能化合物封装在脂质体中。可用的脂质膜泡（脂质体）产生 方法满足了封装水溶性药物的大部分应用（G.Gregoriadis，Ed.，LiposomeTechnology， (2006)LiposomePr巧arationandRelatedTechniques, 3rdEd.)。但是，在脂质体的水 性内部腔室中制造封装略微水溶性的药物（例如，水溶解度小于2mg/mL)的脂质膜泡非常 困难GXZucker等JournalofControlledRelease(2009) 139:73-80,PMID19508880)。
[0009] 被动装载亲脂和在较小程度上两性分子功能化合物比亲水功能化合物些许更有 效，因为它们在脂质双层和脂质体内（内部）水性介质中分开。但是，使用被动装载，最终 功能化合物与脂质比例W及封装效率通常是低的。脂质体中药物的浓度等于周围流体的并 且不捕获在内部水性介质的药物在封装之后被冲洗掉。而且装载至双层的药物当脂质体注 入对象时，非常快速从脂质体释放。为了药物在患者中的持续释放，优选地药物被封装在脂 质体的内部。
[0010] 某些亲水或两性分子化合物可使用跨膜抑-或离子-梯度装载至实施的脂质体 (D.Zucker等，JournalofControlledRelease(2009) 139:73-80)。该技术称为主动或远 程装载。容易主动装载的化合物应能够从可横跨脂质体膜扩散的不带电形式改变为不能运 样的带电形式。典型地，通过将其添加至制备的脂质体悬液，W具有更低的内侧/更高的外 侦UpH-或离子-梯度，装载功能化合物。经主动装载，可实现高的功能化合物与脂质质量比 和高的装载效率（多达100% )。例子是抗癌药物多柔比星、柔红霉素和长春新碱的主动装 载化R.Cullis等，Biochimica et Bio地ysica Acta,(1997) 1331:187-211，和其中的参考 文献）。
[0011] 仅仅认为疏水药物能够通过膜插入经一些被动装载/装配机制装载至脂质体。 Wasan等在使用胶束将微溶性试剂转移至脂质体双层的说明扣S2009/0028931)中声称 "具有疏水性质的试剂可插入脂质双层并且运可通过将试剂添加至实施的脂质体实现"。
[0012] 在药物高于其溶解度界限并且为沉淀形式的条件下将微溶性药物远程装载至脂 质体是出人意料的事件。D.Zucker等，Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80 声称"疏水的分子可聚集，并且运些聚集横跨脂质体膜具有低的通透性。因此，当非极性/ 极性表面积比〉2. 31时（见Zucker等Journal of Controlled Release(2009) 139:73-80 的图4)，药物必须具有合理的溶解度，〉1.9mM，W便实现高装载，因为仅仅可溶性不带电的 分子可进入脂质体。"化Zucker等，Journal of Controlled Release(2009) 139:73-80)。
[0013] 迄今为止，还未开发从沉淀用略微水溶性试剂主动装载脂质体的水性核屯、的方 法。
【附图说明】
[0014] 图1图解了各种类型的脂质体的直径和形态。
[0015] 图2.由包含硫酸钢（浅阴影）或硫酸锭（深阴影）的服PC/化ol/Peg-DS阳组成 的脂质体制剂用卡非佐米W2的输入药物与脂质比使用下述条件溫育。从未封装的药物纯 化脂质体并且显示脂质体中封装的卡非佐米的量，表达为y g卡非佐米/y mol脂质。
[0016]图3是显示捕获试剂对卡非佐米的脂质体装载的作用的条形图。
[0017] 图4是条形图，显示药物引入对卡非佐米的脂质体装载的作用的方法。
[0018]图5是线图，显示由在600nm下的光散射降低表明的卡非佐米从沉淀装载。
[0019] 图6是卡非佐米的HPLC色谱图，为从沉淀装载至脂质体之前（上），W及装载至脂 质体之后并且然后使用其中其在脂质体外溶液中逆向回到沉淀的反向硫酸锭梯度从脂质 体释放（下）。
[0020] 图7是显示作为[DMS0]函数的脂质体封装效率的线图。输入药物与脂质比例是 200 y g/ y mol〇
[0021]图8是显示卡非佐米溶液的光散射作为DMSO浓度的函数的线图。卡非佐米的浓 度是 0. 2mg/mL。
[0022] 图9是显示形成药物沉淀和沉淀的脂质体装载之间延迟时间作用的条形图。
[0023] 图10是显示硫酸锭捕获试剂浓度对从沉淀装载的卡非佐米脂质体药物载荷的作 用的线图。
[0024] 图11是显示硫酸锭捕获试剂浓度对从沉淀的卡非佐米脂质体装载效率作用的线 图。
[00巧]图12是使用=乙基硫酸锭梯度将不溶解的卡非佐米沉淀装载至脂质体的线图。
[0026] 图13是显示通过远程装载将不溶解的卡非佐米沉淀转移至脂质体的线图。
[0027] 图14是显示当与作为SBCD复合物（Abilify)的脂质体混合或当从原料DMS0溶 液直接稀释至脂质体产生药物悬液时比较阿立赃挫的脂质体装载的条形图。
[002引图15是显示药物溶液（深色条）和脂质体药物混合物（灰色条）在600nm的吸 光度（散射）的条形图。矩形指示其中当与脂质体溫育时测量到散射明显下降的样品，指 示药物装载。
[0029] 图16是显示DFX在乙酸巧脂质体中装载效率的条形图。
[0030] 图17是显示包含乙酸巧作为捕获试剂的脂质体中DFX装载容量的图。
[0031] 图18是显示包含不同乙酸醋捕获试剂的脂质体中DFX装载容量的图。

【发明内容】

[0032] 在使用脂质体用于递送功能化合物时，一般期望将脂质体装载至高浓度，产生高 的功能化合物与脂质质量比，因为运减少每次治疗待施用的脂质体的量，W获得需要的疗 效，所有的都因为脂质体中使用的数个脂质本身具有剂量限制性的毒性。装载百分数也对 成本效率具有重要性，因为差的装载导致活性化合物的大量损失。
[0033] 在示例性实施方式中，本发明提供了脂质体，其包含封装内部水性介质的脂质体 脂质膜。内部水性介质包含捕获试剂和略微水溶性治疗剂之间的复合物的水溶液。
[0034] 在进一步示例性实施方式中，本发明提供了药物制剂，其包含本发明的脂质体。制 剂包括脂质体和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。在各种实施方式中，药物制剂为单位剂 量形式，提供单位剂量的封装在脂质体中的治疗剂。
[0035]在另一示例性实施方式中，本发明提供了制备本发明的脂质体的方法。在各种实 施方式中，提供了用略微水溶性的试剂远程装载脂质体的方法。方法包括：a)溫育水性混 合物，其包含：（i)脂质体悬液，其具有横跨脂质体膜存在的质子和/或离子梯度；（ii)与 微溶性药物的水悬液，（iii)其中通过将药物完全溶解在非质子溶剂或多元醇中并且将其 稀释为超过形成沉淀的药物溶解度点的水溶液制备药物悬液，其中溫育组合的脂质体药物 沉淀混合物一段时间响应质子/离子梯度产生积聚在脂质体内部的药物。制备用于用试剂 装载脂质体的混合物，W使横跨内部水性膜和外部水性介质之间的脂质体膜存在质子-和 /或离子-梯度。溫育可为任何有用的时间段，但是优选地为足W使至少部分不溶解的药物 沉淀在质子和/或离子梯度的作用下积聚在内部水性介质中的时间段。
[0036] 在下面详细说明中阐释了其他实施方式、目的和优势。
[0037] 优选实施方式详述 [00測 介绍
[0039] 在利用脂质体用于递送功能化合物时，一般期望将脂质体装载至高浓度，产生高 的试剂-脂质质量比，因为运减少每次治疗待施用的脂质体的量，W获得需要的疗效，所有 的都因为脂质体中使用的数个脂质本身具有剂量限制的毒性。装载百分数也对成本效率具 有重要性，因为差的装载导致在将试剂装载至脂质体期间试剂的损失。
[0040] 本发明提供了脂质体封装试剂，例如，略微水溶性的，制备运样的脂质体的方法， 包含运样的脂质体的制剂和制备本发明的脂质体和制剂的方法。
[0041]在示例性实施方式中，本发明提供了具有封装水性腔室的膜的脂质体。制备脂质 体使得横跨内部水性腔室和外部水性介质之间的脂质体膜存在质子-和/或离子-梯度。 试剂W下述浓度溶解在非质子溶剂中，所述浓度是当稀释在脂质体悬液中形成远程装载混 合物时其在悬液中的溶解度超出并且试剂形成沉淀。一部分试剂沉淀使用横跨内部水性腔 室和外部水性介质之间脂质体膜的质子-和/或离子-梯度装载至脂质体水性腔室。
[0042]在一些实施方式中，远程装载混合物中基本上所有量的不溶解的试剂沉淀装载至 脂质体的水性腔室。在示例性实施方式中，远程装载混合物中至少约95%，至少约90%，至 少约85%，至少约80%或至少约70%的不溶解的药物沉淀装载至脂质体的水性腔室。
[004引脂质体
[0044] 本文根据其通常的含义使用术语脂质体，指由双层憐脂或任何类似的封装内部水 性介质的两性脂质组成的显微脂质膜泡。本发明的脂质体可W是单层膜泡比如小单层膜泡 (SUV)和大单层膜泡（LUV)和多层膜泡（MLV)，尺寸通常从30nm至200nm改变。对本发明 中的脂质体膜结构没有具体限制。术语脂质体膜指分离内部水性介质与外部水性介质的双 层憐脂。
[0045] 本发明使用的示例性脂质体膜可由各种形成膜泡的脂质形成，通常包括双脂族链 脂质，比如憐脂、甘油二醋、双脂族糖脂，单个脂质比如銷憐脂和銷糖脂、胆固醇和其衍生 物，和其组合。如本文定义，憐脂是两性分子试剂，具有长链烷基链形成的疏水基团，和包 含憐酸盐部分的亲水基团。憐脂的基团包括憐脂酸、憐脂酷丙=醇、憐脂酷胆碱、憐脂酷乙 醇胺、憐脂酷肌醇、憐脂酷丝氨酸和其混合物。优选地，憐脂选自1,2-双栋桐酷-sn-甘 油-3-憐酸胆碱值PPC)、二肉豆違酷基-憐脂酷胆碱值MPC)、氨化大豆卵憐脂化SPC)、大豆 憐脂酷胆碱（SPC)、二肉豆違酷基憐脂酷甘油值MPG)、二硬脂酷憐脂酷甘油值SPG)、1-栋桐 酷基-2-油酷基-sn-甘油-3-憐酸胆碱（P0PC)、1，2-二油酷-sn-甘油-3-憐酸胆碱值0PC) 二硬脂酷基憐脂酷胆碱值SPC)、卵黄憐脂酷胆碱巧YPC)或氨化卵黄憐脂酷胆碱（肥PC)、固 醇改性的脂质（SML)、阳离子脂质和反两性脂质。
[0046] 根据本发明的脂质体膜可进一步包括离子载体，如尼日利亚菌素（nigericin)和 A23187。
[0047] 在根据本发明的方法中，示例性脂质体相变溫度在-25°C和100°C之间，例如，在 4°C和65°C之间。相变溫度是诱导组成脂质体的脂质物理状态从有序的凝胶相变成无序的 液晶相需要的溫度，所述凝胶相中控链充分延伸并且紧密堆积，所述液晶相中控链是随机 定向的和流动的。高于脂质体的相变溫度，脂质体膜的通透性增加。选择其中脂质体总处 在凝胶状态的高转变溫度，可提供非渗漏脂质体组合物，即在暴露于环境期间，保持内部水 性介质中略微水溶性试剂的浓度。可选地，转变溫度在所暴露环境的开始和结束溫度之间 的脂质体提供当脂质体超过其转变溫度时，释放略微水溶性试剂的方式。因此，主动装载技 术的过程溫度通常高于脂质体相变溫度，W利于主动装载过程。如本领域通常已知的，脂质 体的相变溫度可受憐脂的选择和添加类固醇如胆固醇、羊毛固醇、胆酱烧醇、豆酱醇、麦角 固醇等参数的影响。因此，在本发明的实施方式中，提供根据任何前述的方法，其中脂质体 包含W数个摩尔比选自不同憐脂和胆固醇的一个或多个组分，W便改变转变、需要的过程 溫度和血浆中脂质体稳定性。混合物中较少的胆固醇导致血浆中较不稳定的脂质体。本发 明中使用的示例性憐脂组合物包括约10和约50mol%之间的类固醇类，优选地胆固醇。
[0048] 根据本发明，可通过现在已知的或随后为制备脂质体开发的任何技术制备脂质 体。例如，脂质体可通过制备多层脂质膜泡（MLVs)的常规的技术形成，即，通过将一个或多 个选择的脂质沉积在适当的容器的内侧壁上通过将脂质溶解在氯仿中并且然后蒸发氯仿， 和然后通过添加待封装在容器中的水溶液，允许水溶液使脂质水合，和使所得脂质悬液縱 满或起满流。该过程产生了包括期望脂质体的混合物。可选地，用于产生大单层脂质膜泡 (LUV)的技术，比如反相蒸发、注入法和去污剂稀释，可用于产生脂质体。产生脂质膜泡的 运些和其他方法的综述可见文本LiposomeTechnology,VolumeI，GregoryGregoriadis Ed.，CRCPress,BocaRaton,Fla.，（1984)，其通过引用并入本文。例如，包含脂质的颗粒 可为下述形式：酱族脂质膜泡，稳定的多层脂质膜泡（SPLV)、单相膜泡（MPV)或脂质基质载 体（LMC)。在MLV的情况下，如果期望，脂质体可进行多个（五个或更多个）冷冻-融化轮， W增强它们的捕获体积和捕获效率并且提供溶质更均匀层间分布。
[0049] 脂质体制备之后，任选地调整脂质体的尺寸，W实现期望的尺寸范围和相对窄的 脂质体尺寸的分布。约20-200纳米的尺寸范围使得脂质体悬液通过常规的过滤器，通常为 0. 22或0. 4微米过滤器，过滤灭菌。如果脂质体的尺寸下降至约20-200纳米，可W高通量 基础进行过滤器消毒方法。数个技术可用于调整脂质体的尺寸至期望的尺寸。通过浴或探 针超声法超声脂质体悬液，产生连续尺寸下降至小单层膜泡，尺寸小于约50纳米。匀化是 另一方法，其依赖于剪切能使大脂质体片段化成更小的脂质体。在典型的匀化方法中，通过 标准乳液匀化器使多层膜泡再循环，直到观察到选择的脂质体尺寸，通常在约50和500纳 米之间。在两种方法中，可通过常规的激光束颗粒尺寸测定，监测颗粒尺寸分布。通过小孔 聚碳酸醋膜或不对称的陶瓷膜挤出脂质体也是使脂质体尺寸降低至相对良好限定尺寸分 布的有效方法。典型地，悬液通过膜循环一次或多次，直到实现期望的脂质体尺寸分布。可 通过连续更小的孔膜挤出脂质体，W实现逐渐减小的脂质体尺寸。可选地，可使用微流体技 术制备控制尺寸的脂质体，其中有机溶剂中，比如乙醇或乙醇-非质子溶剂混合物中的脂 质与水性介质快速混合，从而在尺寸小于300微米和优选宽度小于150微米和高度50微米 的微通道中有机溶剂/水比例小于30%。然后从脂质体通过透析去除有机溶剂。其他可用 的调整尺寸的方法比如超声法、溶剂蒸发或反相蒸发是本领域技术人员已知的。
[0050] 用于本发明各种实施方式的示例性脂质体的尺寸为约30纳米至约40微米。
[0051] 本文提及的内部水性介质，通常是其中制备脂质体并且当形成脂质体时初始封装 的初始介质。根据本发明，新鲜制备的封装初始水性介质的脂质体可直接用于主动装载。 但是，实施方式也设想其中脂质体制备之后脱水，例如用于储存。在运样的实施方式中，该 方法可设及直接添加脱水脂质体至用于产生跨膜梯度的外部水性介质。但是也可能首先在 另一外部介质中使脂质体水合，如本领域技术人员理解的。任选地在减压下使用标准冷冻 干燥装置或等同装置使脂质体脱水。在各种实施方式中，脂质体和它们的周围介质冷冻在 液氮中，然后脱水并且放置在减压下。为了确保脂质体在脱水过程中幸存，而不损失大部分 部分它们的内部包含物，通常采用一种或多种保护糖，W与脂质膜泡膜相互作用并且随着 去除系统中的水，保持它们完整。可使用各种糖，包括运样的糖，如海藻糖、麦芽糖、薦糖、 葡萄糖、乳糖和葡聚糖。一般而言，已经发现二糖比单糖更好，二糖海藻糖和薦糖是最有效 的。也可使用其他更复杂的糖。例如，已经发现包括链霉素和双氨链霉素的氨基糖巧类在 脱水期间保护脂质体。典型地，包括一种或多种糖作为脂质膜泡的内部或外部介质的一部 分。最优选地，糖包括在内部和外部介质中，从而它们可与脂质体膜的内侧和外侧表面相互 作用。通过在脂质体形成过程期间添加糖或糖至封装在脂质膜泡中的缓冲液实现包括在内 部介质中。在运些实施方式中，在主动装载过程中使用的外部介质，也应优选地包括一种或 多种保护糖。
[0052] 如本领域技术人员一般理解，聚乙二醇（PEG)-脂质缀合物已经