（表3)。
[0225] 结果
[0226] 在0. 2mg/mL卡非佐米下，药物沉淀和聚集足够大产生在600nm处的光散射信号。 随着％DMSO增加，信号降低并且指示药物的溶解。我们观察到>25%vol/volDMSO对于W 0. 2mg/mL在65°C溫度下完全溶解药物是必要的。
[0227]
[022引表3.比较在存在和没有25% DMSO的情况下，远程装载阿霉素和17-DMAG至含硫 酸锭的脂质体。
[022引结论
[0230]使用10%v/v或更低的DMSO进行之前的研究装载卡非佐米，并且上面的光散射结 果显示大部分药物在运些条件下是使用浓度的沉淀形式。添加足够非质子溶剂至完全溶解 的药物（即大于25%DMSO,在65°C下）对于两性的弱碱药物的脂质体装载具有不利影响， 指示由例如内容物渗漏或电化学梯度消失造成的脂质体不稳定。在维持好的脂质体稳定性 的条件下，我们没有发现完全溶解卡非佐米的DMSO浓度或可选地我们没有发现药物完全 溶解并且同时脂质体未不利不稳定的使用DMSO的条件。
[0231] 实施例9
[0232] 在形成药物沉淀之后，对卡非佐米的脂质体装载的延迟影响
[0233] 介绍
[0234] 该该申请中描述的发明允许不溶解的药物沉淀装载至脂质体。实施例9评估了药 物沉淀的形成时间和起装载至脂质体时间的作用。
[023引程序
[0236] 由实施例1中描述的相同组合物和方法制备脂质体。
[0237] 卡非佐米溶解在DMS0,浓度为lOmg/mL并且我们添加至2%(v/v)的终浓度至 50mM巧樣酸盐，10%薦糖，pH3.5,不包含脂质体。当添加药物至巧樣酸盐缓冲液时，形成 沉淀。在形成之后立即，比延迟之后或1化延迟之后，将用于装载的脂质体添加至包含药物 沉淀的溶液，并且然后将沉淀使用实施例1中描述的装载条件装载至脂质体。
[023引结果/结论
[0239] 形成药物沉淀的之间和装载沉淀的时间对卡非佐米的脂质体装载程序的效率没 有明显影响，即使如果延迟时间多达12h。
[0240] 实施例10
[0241] 脂质体药物载荷对卡非佐米从沉淀装载的效率的影响
[0242] 程序
[0243] 由如比较捕获试剂中描述相同的组合物和方法制备脂质体，不同之处是捕获试剂 内部硫酸锭的浓度是250mM或500mM。
[0244] 卡非佐米溶解在DMSO中，浓度为lOmg/mL。卡非佐米引入脂质体，对于250mM硫酸 锭作为捕获试剂的脂质体，卡非佐米与服PC比例为91. 8、167、251、338和433g药物/mol 服PC和对于500mM硫酸锭作为捕获试剂的脂质体，卡非佐米与服PC比例未451、546、639和 759g药物/mol服PC。用50mM巧樣酸盐、10%薦糖抑4. 0稀释脂质体W使体积增加至添 加药物之后，终DMSO浓度是10%的点。卡非佐米/DMSO添加至稀释的脂质体，其在室溫下 混合，然后转移至65°C浴并且对于头3min每30s起縱满，并且然后对于30min的总加热时 间每5min起縱满。当添加药物时，所有的样品非常浑浊并且在15min之后都变清澈（与没 有添加药物的脂质体相同）。在加热30min之后，所有的样品放置在冰上15min。如实施例 1中描述纯化和分析装载的脂质体。
[0245] 结果/结论
[0246]
[0247] 随着装载溶液中药物与脂质体输入脂质比例增加，所得药物载荷增加。在用于每 个不同浓度的硫酸锭捕获试剂的最低输入比例下，效率最大。使用该实施例中描述的条件， 卡非佐米可从不溶解的沉淀装载至脂质体至终药物载荷为469 + 4. 9g药物/molHSPC(药 物/载体总脂质重量比为0. 4)，效率为61. 7± 1. 2%。
[024引实施例11
[0249] 使用=乙基硫酸锭梯度，将不溶解的卡非佐米装载至脂质体
[0巧0] 介绍
[0251] 通常使用硫酸锭梯度实现远程装载药物至脂质体。包括使用本文的例子卡非佐米 的一些药物分子具有环氧化物基团，其对于活性是必要的。运些药物的环氧化物潜在地经 受从用于硫酸锭远程装载的任何残留氨氨解。在该实施例11中，硫酸锭用=乙基硫酸锭远 程装载剂替换，W通过用非活性=乙胺置换来消除潜在的氨/环氧化物反应。
[0巧2] 方法
[0253] 通过使用如用远程装载卡非佐米脂质体捕获中描述的相同组合物和程序制备脂 质体，不同之处是50mMS乙基硫酸锭用作捕获试剂。通过用S乙胺滴定1M硫酸至终抑为 7. 3和硫酸浓度为500mM制备=乙基硫酸锭。
[0254] 卡非佐米溶解在DMS0中，浓度为lOmg/mL。卡非佐米引入脂质体，卡非佐米与服PC 比例为650g药物/mol服PC。用50mM巧樣酸盐、10%薦糖抑4. 0稀释脂质体，W使体积增 加至在添加药物之后终DMS0浓度是10%的点。卡非佐米/DMS0添加至稀释的脂质体，起在 室溫下混合，然后转移至65°C浴并且头3min每30s起縱满并且然后每5min起縱满。在装 载程序期间10、20、30和40min去除装载混合物的样品并且放置在冰上15min。使装载脂质 体起縱满并且100yL的样品保持为"柱前"并且静置转移至微离屯、管并且在10, 000RPM下 旋转5min。在Se地adexG25柱上纯化上清液，通过HPLC收集和分析。药物沉淀小球溶解 在DMS0/Me0H(10:l)中并且通过HPLC分析。
[0巧5] 结果/结论
[0256]使用=乙基硫酸锭梯度将不溶解的卡非佐米沉淀装载至脂质体，产生与使用硫 酸锭梯度产生的那些类似的脂质体（实施例1)。图12图解了对于到lOmin快速开始的 脂质体装载的时间依赖性。在30min实现了最大载荷是440 + 12. 6g药物/molHSPC(效 率为65.9±1.98%)。使用5001111^乙胺作为捕获试剂，药物与服?(：比例为650旨药物/ mol服PC的该结果与使用500mM硫酸锭作为捕获试剂的非常类似，药物与服PC比例为 639邑药物/111〇1服?(：，其产生的终药物与脂质比例为440±10.2邑药物/111〇1服?"效率为 68. 7 + 4. 80% )。
[0257] 脂质体外部上不溶解的药物沉淀转移（远程装载）至脂质体内部，如在装载过程 期间混合物中的沉淀量降低所指示。图12显示脂质体外沉淀最大的减少发生在O-lOmin 之间，其对应如图13中可见的将沉淀装载至脂质体。
[0巧引实施例12
[0259] 从沉淀装载另一微溶性药物
[0260] 介绍
[0261] 另一药物，阿立赃挫由横下基环糊精（SBCD)配制并且用于治疗双极性病症和精 神分裂症（Abilify，Pfizer)。药物非常不溶于水并且当添加至脂质体悬液时，立即观察到 精细沉淀。
[0262] 测试阿立赃挫是否在上面为卡非佐米阐释的类似条件下远程装载。
[0263] 方法
[0264] 将包含250mM硫酸锭或250mM硫酸钢的脂质体化SPC/Chol/PEG-DSPE 3/2/0. 15mol/mol/mol)稀释在1ml的50mM巧樣酸、10% (wt/wt)薦糖，pH4. 0至浓度为 6mM憐脂。从DMS0中15mg/mL的原料液添加0. 3mg的阿立赃挫，从而终DMS0浓度是2% (v/ V)。在药物添加至两个脂质体样品之后，立即观察到精细沉淀。样品在65°C下加热30min， 然后在冰上冷却。通过0. 2um聚酸讽注射器过滤器过滤样品，W去除任何药物沉淀，随后在 pH6. 5的皿S平衡的Se地adexG25柱上纯化至去除任何可溶性超脂质体药物。如上述收 集和分析脂质和药物的浑浊部分。
[0265] 结果
[0266]
[0267]表5.将阿立赃挫装载至包含硫酸锭和硫酸钢的脂质体的结果。
[026引发现包含硫酸锭的脂质体装载约85%的药物，而装载至硫酸钢脂质体小于2%， 硫酸锭脂质体可获得的能力装载约50倍增加，W利于远程装载（表5)。
[0269]阿立赃挫，当W SBCD复合物（来自药学产品Abilify)形式引入脂质体溶液时，在 相同浓度和装载条件下产生的装载效率为68% (图14)。
[0270] 结论
[0271] 运是可使用上述方法将差的可溶性药物远程装载至脂质体的另一实施例，并且比 如果药物作为SBDC复合物引入，产生稍微更好的装载。
[0272] 实施例13
[0273] 通过将来自稀释各种药物溶剂溶液制备的沉淀的微溶性药物装载至脂质体溶液
[0274] 该实施例描述了不良可溶性药物远程装载至脂质体的技术，其开始将药物溶解在 起初当添加至脂质体的水溶液时形成药物沉淀的增溶剂。在一些溫育时间响应电化学梯度 药物进入脂质体积聚在脂质体核屯、中。可使用的溶剂包括但不限于二甲亚讽、二嗯烧、四氨 巧喃、二甲基甲酯胺、乙腊、乙酷二甲胺、环下讽、丫下内醋、化咯烧酬、1-甲基-2-化咯烧 酬、甲基化咯嘟、乙二醇一甲基酸、二甘醇一甲基酸、聚乙二醇。
[0275] 方法
[027引阿立赃挫溶解在一系列溶剂中，指示低于4mg/mL。使用由在250mM硫酸锭中制 备的HSPC/Chol/PEG-DSPE(3/2/0. 15mol/mol/mol)组成的脂质体并且在Hepes缓冲的薦 糖10% (wt/wt)她Sue pH 6. W中稀释至6mM。通过缓慢添加每种溶剂同时起满流，引入 0.3mg的药物。对于所有样品，终溶剂浓度是7. 5%。作为对照，从每个溶剂将药物添加至 相同体积的没有脂质体的抑6.5的皿Sue。样品在65°C下加热30min，然后在冰上冷却。 在再次达到室溫之后，测量样品在600皿处的吸光度（Cary lOOBio UV-Vis分光计）并且 值显示在下方（图15)。
[0277]结果
[027引所有没有脂质体的溶液变得非常浑浊或有粗糖的沉淀和沉降（尤其在甲醇和 1-下醇的情况下）。一些脂质体样品也非常浑浊，但是一些澄清药物沉淀与之前的结果一 致，指示已经发生了药物沉淀的药物装载（即在药物初始溶解在DMS0、1-4-甲基化咯烧酬、 二亚乙基单乙酸或聚乙二醇（MW400)的情况，见图15。
[0279] 实施例14
[0280] 使用乙酸盐梯度将地拉罗司的不溶解沉淀远程装载至脂质体
[0281] 将地拉罗司远程装载至包含乙酸巧的脂质体表明乙酸盐梯度对于装载铁馨合剂 的用途。乙酸巧梯度远程装载与硫酸锭远程装载的不同在于装载的药物分子必须具有簇酸 (或异径朽酸）而不是胺。已知地拉罗司具有显著的肾毒性并且脂质体递送是用于减轻肾 毒性的技术。
[0282] 方法
[028引W如Clerc和Barenholtz1995(PMID8541297)的乙酸盐装载可溶性簇基巧光素 和糞晚酸的相同方式使用乙酸盐梯度进行远程装载地拉罗司不溶解的沉淀至脂质体。如实 施例1中描述制备脂质体，但是在该情况下在抑8的120mM乙酸巧的溶液中挤出脂质体。 通过外部介质替换为抑6.0的120mM硫酸钢形成乙酸盐梯度。地拉罗司溶解在DMS0中， 浓度为lOmg/ml并且添加至其形成沉淀的脂质体悬浮。通过加热至65°C，比使装载至脂质 体沉淀并且如实施例1中描述进行纯化和分析。
[0284]结果
[02财当从lOmg/mlDMS0原料液稀释至脂质体装载悬液中Img/ml的浓度时，由于其差 的水溶解度（~0.038mg/mL)，地拉罗司形成沉淀。使用乙酸巧梯度，W大于其装载至包含 硫酸钢和没有乙酸盐梯度的对照脂质体的至少5倍的效率将不溶解的地拉罗司沉淀装载 至脂质体。
[0286] 将不溶解的地拉罗司沉淀远程装载至脂质体提供了乙酸盐梯度从沉淀远程装载 簇酸药物的用途的例子。在该例子中，装载的药物是馨合剂，尤其是铁馨合剂。相对对照脂 质体，5倍更大装载至具有乙酸盐梯度的脂质体指示大部分地拉罗司被远程装载而不是插 入脂质双层中。
[0287] 实施例15
[028引介绍
[0289] 卡非佐米的脂质体递送的一个目标是避免药物降解和消除，其要求药物保留在脂 质体中。评估药物在脂质体内驻留的一个技术，和因此从脂质体递送获得的好处是测量小 鼠中药物的药物动力学。在脂质体中具有更大药物驻留的稳定制剂在小鼠血浆中相比较不 稳定的制剂或未封装的药物，产生较高浓度的非代谢药物。
[0290] 材料和方法
[02W]形成lOOnm由服PC/ 胆固醇 /PEG-DSPE(60/40/5mol/mol/mol)和銷憐脂 / 胆固醇 /PEG-DSPE(55/45/2.8，mol/mol/mol)组成的脂质体，使用实施例1中描述的方法纯化和药 物装载卡非佐米。用于远程装载卡非佐米的捕获试剂是=乙基葡聚糖硫酸锭（1.0MS〇4)或 S乙基薦糖八硫酸锭（1.0MS〇4)。通过正切流过滤，用缓冲液替换成抑6.5的皿S，纯化 药物装载脂质体。通过0. 2um聚酸讽过滤器无菌过滤脂质体并且如实施例1中描述评估卡 非佐米和脂质含量。计算药物与脂质比例、药物浓度和装载效率并且结果显示在表6中。
[0292] 结果
[0293]
[0295] 表6.IV.施用脂质体制剂之后，小鼠血浆中的卡非佐米浓度。
[0296]t制剂#3与#2相同，不同之处是储存在4°C下30天，然后PK分析
[0297]另外，我们检查了封装在脂质体制剂中的卡非佐米在雄性CD1小鼠中的药物动力 学。经尾静脉W5mg/kg卡非佐米使用3小鼠/制剂，通过IV弹丸注射对小鼠给药。在地， 处死小鼠并且通过离屯、血液收获血浆。0. 1ml的血浆混合0.2血甲醇，充分混合并且通过 HPLC如实施例1中描述测量卡非佐米浓度。装载效率、药物/脂质比例和尾静脉注射脂质 体卡非佐米之后4小时之后血浆中残留的注射剂量的百分数（％ID@4h)显示在表6中。尽 管不尝试区分血浆中非脂质体捕获的和脂质体捕获的药物，如我们的分析测量总的药物含 量，我们假设大部分测量的卡非佐米是脂质体捕获的，因为药物在血流中非常快速地消除 (ti/2<2〇min)(Yang等2011，DrugMet油Dispos.2011 0ct;39(10):1873-8。。我们观察了 100倍范围药物驻留从0.65%至66.3%ID,运取决于脂质体制剂组成。测试的最稳定的脂 质体是基于銷憐脂的并且包含内部葡聚糖硫酸锭溶液。上述脂质体使卡非佐米的血浆驻留 在施用后4h增加46至4735倍大于SBCD制剂，或5至510倍大于公开的脂质体制剂。（化U 等 2012AAPSMeeting,化sterT2082)。
[029引实施例16
[0299] 使用乙酸盐梯度远程装载不溶解的地拉罗司沉淀至脂质体
[0300] 介绍
[030。远程装载地拉罗司值F讶至包含乙酸巧的脂质体表明乙酸盐梯度用于装载铁馨 合剂的用途。乙酸巧梯度远程装载与硫酸锭远程装载的不同在于装载的药物分子必须具有 簇酸（或异径朽酸）而不是胺。已知地拉罗司具有明显的肾毒性并且脂质体递送是降低肾 毒性的技术。
[0302] 方法
[0303] 使用实施例1中描述的挤出和纯化方法制备脂质体。脂质组分是服PC/胆固醇 (3/0. 5,mol/mol)或P0PC/胆固醇（3/0. 5,mol/mol)。捕获试剂由每个浓度为120mM的乙 酸巧或硫酸钢组成。DMS0中20mg/mL的DFX溶液在30秒内缓慢添加至脂质体溶液，同时起 满流，W在脂质体溶液中产生药物沉淀。祀药物与憐脂比例是lOOgDFX/mol憐脂。溶液加 热30min(P0PC脂质体在45°C下和服PC脂质体在65°C下）并且然后在冰上冷却。去除样 品，化测定输入药物与脂质比例和在离屯、机中W12, 000RPM离屯、残留的溶液5分钟，使任何 未装载的药物成为小球。使用Se地adexG25尺寸排除柱，5mM肥阳S，145mM化C1，pH6. 5 洗脱进一步从未装载的药物纯化上清液。通过HPLC使用实施例1中描述的系统和下述程 序分析纯化的脂质体的药物和脂质含量，所述程序由下述组成：6min中65%B至98%B的 梯度洗脱，5min平衡回到 65%B(A= 0. 1%TFA，B= 0. 1%TFA/MeOH，1. 0血/min)，柱溫度 保持恒定在30°C，lOul注射，和通过在254nm处的吸光度检测。
[0304] 结果
[0305] 当将DMS0中的药物添加至包含乙酸巧作为捕获试剂的脂质体时，P0PC脂质体的 溶液较在装载之前都包含沉淀药物的HSPC脂质体的溶液不浑浊。加热之后，溶液澄清并且 外观如没有药物沉淀的脂质体。包含硫酸钢作为对照捕获试剂的脂质体在加热期间从不澄 清并且当离屯、时形成药物沉淀小球。装载由P0PC和HSPC制备的包含乙酸巧的脂质体非常 有效。包含捕获乙酸巧的脂质体产生>90%的装载效率。包含硫酸钢的脂质体产生3. 3% 的装载效率，其指示DFX装载至乙酸巧脂质体不是被动的而是可描述为远程装载。DFX装载 结果显示在表7中（图16)。
[0306]
[0308] 表7.乙酸巧脂质体2中的DFX的装载效率
[0309] 结论
[0310] 远程装载地拉罗司的不溶解沉淀至脂质体提供了乙酸盐梯度从沉淀远程装载簇 酸药物用途的例子。在该例子中，装载的药物是馨合剂，尤其是铁馨合剂。相比对照脂质体 28倍更大的装载至具有乙酸盐梯度的脂质体，指示大部分地拉罗司被远程装载而不是插入 脂质双层中。
[0311] 实施例17
[0312]