病，链球菌感染后肾小球肾炎、逆流肾病、肾动脉栓塞、肾动脉狭 窄、肾乳头状坏死、I型肾管状酸中毒、II型肾管状酸中毒、肾灌注不足、肾静脉血栓形成。
[0139] 在示例性实施方式中，本发明提供了治疗金属毒性或金属过载的方法。与金属相 关的疾病或病症包括铁过载病症（例如，地中海贫血或镶刀细胞贫血）、铜过载病症（例 如，Wilson疾病），和放射性同位素污染（例如，用坏、轴和其他放射性同位素污染之后发生 的）。
[0140]"有效量"或"有效量的"指本发明的药物制剂当单个或多个剂量施用至对象时有 效处理细胞或治愈、减轻、缓解或改善病症的症状的量。组合物的有效量可根据下述因素而 改变：比如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和化合物在个体中引起期望应答的能力。有 效量也是其中组合物的治疗有益的超过任何有毒或有害作用的量。
[0141] 如本文所使用，术语"预防"或"预防的"，如在将试剂施用至对象的背景下使用，指 使对象经历下述方案，例如，施用本发明的药物制剂使得相比在没有该方案的情况下，病症 的至少一种症状的出现被延迟。
[0142] 如本文所使用，术语"对象"旨在包括人和非人动物。示例性人对象包括具有病症， 例如，本文所述病症的人患者，或正常对象。术语"非人动物"包括所有的脊椎动物，例如， 非哺乳动物（比如鸡、两栖动物、爬行动物）和哺乳动物，比如非人灵长类、家养的和/或农 业用途的动物，例如，绵羊、狗、猫、母牛、猪等。
[0143] 如本文所使用，术语"治疗（treat)"或"治疗（treating)"具有病症的对象，指使 对象进行方案，例如，施用本发明的药物制剂使得病症的至少一种症状被治愈、愈合、缓解、 减缓、改变、补救、减轻或改善。治疗包括施用有效减轻、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响 病症或病症症状的量。治疗可抑制病症症状的劣化或恶化。
[0144] 提供下述实施例，W阐释本发明的示例性实施方式并且不解释为限制本发明的范 围。 实施例
[0145] 实施例1
[0146] 通过远程装载捕获的卡非佐米脂质体
[0147] 材料和方法
[014引通过将硫酸锭固体溶解至终浓度为250mM巧00m当量的阴离子/L)制备硫酸锭溶 液，不进行抑调节，W产生终抑为5. 6。通过添加0. 35g硫酸钢至lOmL去离子水制备硫酸 钢溶液（250mM)。
[0149] 通过挤出形成脂质体。在65°C下脂质溶解在乙醇中，浓度为500mMHSPC(591mg/ mL总脂质）并且加热至65°C的9体积的捕获试剂溶液添加至也在65°C的乙醇/脂质溶液。 使混合物起縱满并且转移至10血恒溫控制（65°C)Lipex挤出机。通过经具有0.lum孔的 聚碳酸醋膜挤出10次形成脂质体。在挤出之后，脂质体在冰上冷却。通过在分子量截取为 12, 000-14, 000的透析管道系统中透析纯化脂质体形成跨膜电化学梯度。用5mM肥PES， 10%薦糖抑6. 5 (在4°C下揽拌），W大于样品体积100倍体积透析样品。化之后改变透析 液，在每1化之后再4次。巧慢脂质体溶液的电导率并且不能与透析介质区分，~40yS/ cm〇
[0150] 通过HPLC测量胆固醇而测量脂质浓度，使用AgilentIIOOHPLC用和Agilent Zorbax5um，4. 6x150mM，EclipseXDB-C8柱和流动相A= 0. 1%TFA，B= 0.l%TFA/MeOH， 无梯度洗脱为99%B。流速是1. 0血/min,柱溫度是50°C，10yL注射和通过在205皿的吸 光度检测。胆固醇的保留时间是4. 5min。通过动态光散射测量脂质体尺寸。
[0151] 卡非佐米（Selleck化emicals)溶解在DMS0中，浓度为lOmg/mL。卡非佐米引入脂 质体卡非佐米与服PC比例为lOOg药物/mol服PC(药物与总脂质比例（wt/wt)为0. 12)。 用50mM巧樣酸盐、10%薦糖抑4. 0稀释脂质体，W增加体积至添加药物之后终DMS0浓度 是2 %的点。卡非佐米/DMS0添加至稀释的脂质体，其在室溫下混合然后转移至65°C浴并 且头3min每30s起縱满并且然后在30min的总加热时间内每5min起縱满。当添加药物时 所有的样品非常浓，并且15min之后所有的都变透明（与没有药物添加的脂质体相同）。在 加热30min之后，所有的样品放置在冰上15min。装载的脂质体起縱满并且100yL的样品 保持为"柱前"并且静置转移至微离屯、管并且在10, 000RPM下旋转5min。在Se地adexG25 柱上纯化上清液，通过HPLC收集和分析。在如为分析胆固醇描述的相同的系统上进行卡非 佐米的HPLC分析。流动相由A= 0. 1 %TFA、B= 0. 1 %TFA/MeOH组成，W50%B开始梯 度洗脱并且在13min内增加至83%B，7min平衡回至50%B。流速是1.OmL/min，柱溫度是 30°C，10y1注射和通过在205nm的吸光度检测。卡非佐米的保留时间是12. 2min。通过 HPLC分析胆固醇测定脂质浓度。
[0152] 结果
[0153] 装载包含250mM硫酸锭的脂质体当WlOOg药物/mol的服PC脂质添加药物 巧5. 26 ± 3. 47 %的效率）时，产生终药物与脂质比例为95. 26 ± 3. 47g药物/mol的服PC脂 质体和当W200g药物/mol的服PC脂质添加药物时化7. 94 + 3. 67%的效率）时，终药物与 脂质比例为136. 9 + 7. 35g药物/mol的服PC脂质体（图2)。运表明运些具体脂质体的装 载容量在100和200g药物/mol憐脂之间。没有用于远程装载的电化学梯度的包含250mM 硫酸钢的对照脂质体当W100和200g药物/mol的服PC比例添加药物时分别产生的终药 物装载为33. 28 + 0. 79和29. 01 ±0. 79g药物/mol的服PC。运表明低于lOOg药物/mol的 服PC装载运些脂质体的容量是饱和的并且W该药物输入比例远程装载脂质体展示〉3倍更 高的装载容量。药物装载容量对于硫酸钢脂质体比硫酸锭脂质体的饱和至少3倍更低的比 例，指示当远程装载没有电化学梯度时，药物分割进入脂质双层，但是不与内部捕获试剂形 成盐。图5图解了在用硫酸钢脂质体的装载过程之后仍存在沉淀，但是用硫酸锭脂质体没 有。
[0154] 结论
[0155] 具有相同脂质基质组成和尺寸，但是内部捕获的硫酸组成不同的脂质体盐的脂质 体具有不同的装载卡非佐米容量。能够产生电化学梯度（硫酸锭）的脂质体在最佳条件下 能够装载接近至100%的药物并且能够产生具有差装载效率的梯度，提示远程或主动装载 是卡非佐米并入脂质体的主要机制。
[0156] 实施例2
[0157] 比较脂质体捕获试剂 [015引介绍
[0159] 在旨在作为盐复合装载药物的离子溶液中形成用于远程装载的脂质体。捕获试剂 可与装载药物形成复合物并且该复合物的稳定性是指示脂质体药物装载能力、稳定性和药 物释放速度的一个因素。通过评估卡非佐米装载的效率进行比较不同的脂质体捕获试剂。
[0160] 方法
[016。 使用S个脂质体制剂，所有的摩尔比3HSPC/2化01/0. 15PEG-DSPE，每个具有不同 的捕获试剂：1.苯六酸；2.硫酸锭；和3.糞二横酸。
[016引苯六酸（MA)溶解在水中并且用二乙胺滴定至终抑为5. 5和浓度为83mM(500m当 量的阴离子/L)。通过将硫酸锭固体溶解至终浓度为250mM(500m当量的阴离子/L)制备硫 酸锭，不进行抑调节，W产生终抑为5. 6。
[0163] 糞二横酸（ND巧溶解在水中并且用二乙胺滴定至终抑为8.0和浓度为 250mM巧00m当量的阴离子/L)。
[0164] 如何制备、纯化和表征脂质体的细节见实施例1，通过远程装载捕获卡非佐米脂质 体。
[0165]
[0166] 为了保完全去除与卡非佐米一起添加的DMSO,在分子量截取为12, 000-14, 000的 透析管道系统中透析脂质体卡非佐米样品。用5mM肥阳S，10%薦糖抑6. 5(在4°C下揽 拌），W大于样品体积100倍体积透析样品。化之后改变透析液，然后在1化之后每次另外 2次。再次如上述分析药物和脂质浓度的卡非佐米脂质体。
[0167] 结果
[016引对于捕获试剂为苯六酸、硫酸锭和糞二横酸的脂质体，卡非佐米WlOOg药物/mol的服PC脂质远程装载至脂质体的效率分别为37. 4% ±2.01 %、97.0% ±2. 38%和95. 1 % ±1.76% (图 3)。
[0169] 结论
[0170] 本文描述的发明确保可用包括苯六酸、硫酸锭和糞二横酸的各种捕获试剂产生的 各种使用电化学梯度实现来自不溶解沉淀的卡非佐米远程装载至脂质。
[0171] 实施例3
[0172] 比较引入药物的方法
[0173] 方法
[0174] 比较装载程序期间用于添加药物至脂质体的方法。装载程序如上面实施例1描述 的相同，不同之处是药物作为固体粉末添加至脂质体装载溶液，作为lOmg/mLDMS0溶液快 速和作为lOmg/血DMS0溶液缓慢。
[0175] 结果
[0176] 对于作为固体粉末添加的药物，卡非佐米WlOOg药物/mol的服PC脂质远程 装载至脂质体的效率当加热至65°C30和120min时分别是3. 88% ±0.053%和3. 47% ± 0. 030 %。当快速添加药物/DMS0时，作为lOmg/血DMS0溶液的装载药物的效率是97. 0 % ±2. 38%和当药物/DMS0在Imin内W5个递增添加至脂质体溶液同时起满流时是96. 3% ± 1. 09 %。来自缓慢药物添加的药物/脂质体混合物比源自快速添加药物的药物/脂质 体混合物更清澈。但是，在加热至65°C，30min之后，两个溶液都没有可见的沉淀（或W 10, 000rpm，5min的离屯、沉淀），其是由于所有的药物装载至脂质体，无论当添加药物时是 否形成沉淀（图4)。
[0177] 实施例4
[017引在室溫下卡非佐米装载至脂质体
[0179] 介绍
[0180] 在室溫下将药物装载至脂质体的能力有利于降低热诱导的药物降解，简单地制造 和允许床边脂质体装载。有效的运输横跨脂质体膜要求膜为流动相。运通过在装载过程期 间将脂质体加热高于Tm，用具有高相变溫度灯m)的饱和的憐脂，比如HSPCa"= 55°C)实 现。加热的可选方式是使用在室溫下为流动相的脂质。运些脂质的劣势是它们在循环中不 稳定并且产生快速药物释放。固醇改性的脂质并入新的脂质构建，其中胆固醇（酱醇）共价 连接至憐酸头基。已经证明了固醇改性的脂质使得酱醇在循环中与脂质双层不可交换的。 固醇改性的脂质在室溫下也是流动相，使得它们对于室溫装载药物至待用于体内递送疗法 的脂质体是理想的。
[0181] 方法
[0182] 通过使用两个脂质体制剂进行在室溫下装载卡非佐米至脂质体，所述脂质体制剂 由摩尔比 95PChemsPC/5PEG-DSPE的和另一摩尔比 3P0PC/2Chol/0. 15PEG-DSPE的组成，每 个包含250mM硫酸锭作为捕获试剂。使用如实施例1中描述的程序、药物/脂质体比例、pH 下的缓冲液制备脂质体。在室溫下（20°C)揽拌脂质体并且卡非佐米作为lOmg/mLDMS0 溶液在Imin内5个递增添加，W产生浑浊溶液。在室溫下揽拌脂质体/药物混合物总共 30min，W产生透明溶液，相同外观如添加药物之前的脂质体溶液。
[0183] 结果
[0184]WlOOg药物/mol的rchemsPC，卡非佐米远程装载至脂质体的效率是95. 5 % ± 1. 23%。W187g药物/mol的3P0PC/2Chol/0. 15PEG-DSPE，卡非佐米远程装载至脂质体 的效率是 100. 52% ±1.01%。
[01财结论
[0186] 本文描述的发明，不能通过直接将结晶形式的药物添加至装载溶液，将卡非佐米 装载至脂质体。药物需要溶解在一些溶剂中，然后W高于药物溶解度的浓度添加至装载溶 液。当将药物添加至装载溶液时形成的沉淀的脂质体装载效率不依赖于在该情况下使用卡 非佐米的添加。
[0187] 实施例5
[018引药物沉淀装载至脂质体，如通过在600nm的光散射测定。
[018引介绍
[0190] 脂质体装载来自沉淀的药物至脂质体的证据是所得药物与脂质比例和随着药物 沉淀转移至脂质体，溶液的清澈。为了获得从药物沉淀的定量测量脂质体装载，在装载过程 期间，在600nm下测量光散射。
[0191] 方法
[0192] 脂质体包含250mM硫酸锭作为捕获试剂和250mM硫酸钢作为不远程装载药物的对 照脂质体。制备脂质体不去使用实施例1中描述的程序装载，不同之处是一次性聚苯乙締 试管用作反应容器。用UV/vis分光光度计在装载过程期间测量在600nm处的光散射。
[0193] 结果/结论
[0194] 硫酸钢脂质体在装载程序期间不显示沉淀的任何澄清，指示药物不远程装载至脂 质体。（见图5)。硫酸锭脂质体有效装载药物，在15min内使得溶液澄清。
[0195] 实施例6
[0196] 确认从远程装载脂质体的药物释放
[0197] 介绍
[019引反相梯度用于尝试从脂质体中释放活性药物。理论是如果药物可从脂质体内W反 相梯度释放，体内发生药物释放的概率高。
[0199] 方法
[0200] 如在实施例1中描述描述用卡非佐米装载脂质体并且纯化至去离子水。样品分 成两个等分试样。向第一等分试样，添加浓缩的化pesPH7.4和化C1，从而终浓度是5mM 化pes、145mM化Cl(皿巧。向第二等分试样，添加浓缩的硫酸锭，从而终浓度是250mM。没有 初始观察到明显的物理改变。然后在65°C下加热样品30min。将样品转移至清洁巧pendorf 管并且10, 000巧m离屯、5min，其后分开上清液和沉淀并且通过HPLC试验测试卡非佐米含 量。释放药物的沉淀，残留在上清液中封装药物的脂质体。如下计算释放的％卡非佐米：
[0201]
[0204] 表2.从脂质体的反相梯度引导的药物释放
[0205] 使用反相梯度的药物释放比从没有反相梯度对照的药物释放大6. 5倍（表2)。释 放药物的HPLC色谱图与开始材料相同，指示没有发生卡非佐米的降解（图7)。卡非佐米 的原料液的HPLC保留时间是12. 2min和从远程装载脂质体释放的卡非佐米的保留时间是 12. 3min，如图6中显示。运些两个分离时间在HPLC系统的变型内并且彼此不是统计上不 同的。
[0206] 结论
[0207] 使用反相梯度从脂质体释放卡非佐米，W产生如HPLC分析指示的初始分子。
[020引 实施例7
[0209] 作为DMS0含量的函数的卡非佐米装载
[0210] 介绍
[0211] 当添加至脂质体时，药物的物理形式对于装载效率是重要的，即，当作为干燥粉末 添加时，几乎没有观察到装载，但是使用非质子溶剂中的预溶解的溶液添加可导致高的捕 获效率。该研究研究非质子溶剂浓度对卡非佐米的药物装载效率的作用。
[0212] 方法
[0213] 包含硫酸锭的脂质体稀释在50mM巧樣酸薦糖（10%wt/wt)缓冲液抑4. 0至ImM 憐脂。添加各种量的DMS0,从而当从lOmg/mLDMSO的卡非佐米溶液添加200yg药物时，终 DMSO浓度范围是1-10%v/v。
[0214] 结果
[0215]DMSO对卡非佐米远程装载至脂质体的能力具有显著影响。当缺少时，实际上无装 载。在浓度1 %和之上，装载效率范围是74-94%，在更高的DMS0浓度下观察到更高的效率 (图7)。应当注意，在所有样品中在开始装载之前观察到药物沉淀，提示本文使用的DMSO 的浓度小于W使用的药物浓度（〇.2mg/mL)有效溶解卡非佐米需要的最小浓度。
[0引引结论
[0217]引入预溶解的卡非佐米对于有效的远程装载是必要的。但是，高于1%DMS0,存在 装载效率相对小的改变，多达10%。
[0引引实施例8
[0219] 作为DMSO含量的函数的卡非佐米溶解度
[0220] 介绍
[022。 在上述条件下，卡非佐米溶解在DMSO中，然后稀释在脂质体缓冲液溶液然后装 载。其然后就在远程装载之前沉淀。该研究设计为在室溫下和在脂质体装载至由高Tm脂 质（65°C)组成的脂质体需要的溫度下测定有效溶解卡非佐米的DMSO浓度。
[0222] 方法
[0223] 卡非佐米从DMSO中的原料lOmg/mL溶液添加至1ml的巧樣酸/DMSO混合物，从 而DMSO的组分是2 %、25 %、50 %、75 %和100 %。终药物浓度是0. 2mg/mL。制备溶液并且 测量600nm处的光密度。600nm处的光密度是溶液中多少浑浊或多少散射材料（比如药物 沉淀）的良好测量，一般而言，沉淀越多，吸光度越高。从图8,明显的是在小于50%vol/ vol(25°C)和25%vol/vol(65°C)的DMSO浓度下，药物W沉淀形式残留。仅仅当DMSO的 浓度增加时，其的确在0. 2mg/mL的浓度下有效溶解。
[0224] 为了测试25%DMSO中脂质体的完整性，我们尝试远程装载水溶性弱碱药物多柔 比星和17-二甲基氨基乙基氨基-17-脱甲氧格尔德霉素（17-DMAG)并且比较没有DMSO的 相同装载。我们发现不利影响装载效率