甲氧基乙基）赃嗦代替制造例1中的4-赃晚基赃晚，W收率86%得到 黄色油状物的化合物（IV-3)。 阳34U Ih醒R(300MHz，CDCI3) 5 2. 12-2. 15(m，10H) ,2. 81-2. 83(m，2H) ,3. 30(s，3H)， 3. 45-3. 50 (m，2H)，7. 31-7. 48 (m，2H)
[0342] MS (TOF Mass) :m/z calcd for [16?典02(M+1) 277. 19 ;found :277. 18. 阳3创[制造例" 阳344]化合物（IV-4)的合成
阳346]使用1-[双（4-氣苯基）甲基]赃嗦代替制造例1中的4-赃晚基赃晚，W收率 73%得到作为白色固体的化合物（IV-4)。 阳347] iHMffi(300MHz，CDCl3) 5 2.41-2.55 (m，10H)，2.82-2.88(m，2H)，3.16-3.22(m，2田，4. 21(S，1H)，6. 92-7. Ol (m，4H)，7. 31-7. 38 (m，2H)，7. 42-7. 58 (m，4H)，7. 92-7. 98 (m， 2H)
[0348] MS(TOF Mass) :m/z calcd for CzeHzeFzNzO(M+1)421. 20 ;found :421. 23. 阳349]实施例I [0350][ 一次筛选] 阳細](1)质粒pACYCDuet-1-Phe的制作 阳35引将制作的质粒pACYCDuet-1-Phe(序列编号1)的载体图谱示于图1左侧。在NNN中设计作为苯丙氨酸密码子的TTT。根据正常的阅读框进行翻译时，紧接TTT之后出现作 为终止密码子的TAA，蛋火虫巧光素酶（FireflyIuciferase)不被翻译。另一方面，在TTT 中发生错译，跳读一个T时，避开了终止密码子，蛋火虫巧光素酶被正确翻译。目P，翻译的正 确性越高，蛋火虫巧光素酶的巧光强度越低。 阳35引另一方面，作为对照，在该质粒中还克隆了海肾巧光素酶巧enilla Iuciferase)。[0354]向质粒pACYCDuet-1 (Novagen公司制）中导入蛋火虫巧光素酶的碱基序列（序列 编号2)、海肾巧光素酶的碱基序列（序列编号3)、及检测错译的序列（序列编号4)，制作 pACYCDuet-1-Phe(序列编号1)。用所得到的pACYCDuet-1-Phe转化大肠杆菌D册a(宝生 物公司制），进行大量培养后，使用Plasmid Maxi prep kit(Qiagen公司制）提取质粒并进 行纯化。 阳355] 使用ABI Prism SlOgenetic analysis(美国应用生物系统公司制）对所得的pACYCDuet-1-Phe进行碱基序列确认。 阳356] (2)双巧光素酶分析
[0357] 使用培养基IOOmL在37°C下对导入了pACYCDuet-1-Phe的大肠杆菌培养过夜。确 认达到〇〇55。二0. 4~1后，WImL为单位量分注培养基，添加低分子化合物W使最终浓度 为10JiM。振荡培养1小时后，回收大肠杆菌，使其悬浮于IOmMTris-肥1 (抑7.4)UmM氯化 儀、0.Img/mL溶菌酶（和光纯药公司制）进行裂解。 阳35S]使用Dual-Lucifierase R巧orter Assay System(普洛麦格公司制）测定蛋火虫 巧光素酶及海肾巧光素酶的活性。对于溶解的大肠杆菌液5yL添加50yL蛋火虫巧光素 酶用测定液进行测定，然后添加50yL海肾巧光素酶用测定液进行测定。作为对照，准备仅 添加了DMSO的大肠杆菌裂解液。 阳359] 使用下述式，通过相对于海肾巧光素酶来对蛋火虫巧光素酶的发光强度进行校 正。图1中对上述一系列实验方法进行了图解。
[0360] 相对发光强度=蛋火虫巧光素酶/海肾巧光素酶 阳361] 相对翻译精度=相对发光强度（仅添加DMSO时）/相对发光强度（添加化合物 时） 阳362] 将通过一次筛选得到的研究化合物对翻译精度的影响的结果示于图2。图的下部 示出的表的上段为通过上述式校正后的相对发光强度的值。在此，数值相较于1越小，表示 翻译精度越高。下段的值为用于一次筛选的累计化合物数。 阳363] 将使用上述筛选法对作为现有的糖尿病治疗药的捷诺维（Januvia) (MSD公司 制）、格列本脈（Glibenclamide)(和光纯药公司制）、阿卡波糖（Acarbose) (Sigma公司 制）、及二甲双脈（Met化rmin)(和光纯药公司制）进行筛选的结果示于图3。纵轴表示W 对照作为1的相对翻译精度。显示出与对照相比现有的糖尿病治疗药中不存在显著改善翻 译精度的药物。
[0364] 将使用上述筛选法对乙赃立松（化合物1-1)进行筛选的结果示于图4。纵轴表示 W对照作为1的相对翻译精度。与对照相比，氣西汀显示出使翻译精度提高约1. 5倍。
[0365] 将使用上述筛选法对氣西汀（化合物II-1)进行筛选的结果示于图5。纵轴表示 W对照作为1的相对翻译精度。与对照相比，氣西汀显示出使翻译精度提高约1. 5倍。 阳366] 将使用上述筛选法对埃替拉韦（化合物III-1)进行筛选的结果示于图6。纵轴表 示W对照作为1的相对翻译精度。与对照相比，埃替拉韦显示出使翻译精度提高约8倍。 阳367] 将使用上述筛选法对作为W乙赃立松和氣西汀共同的骨架为基础进行了改变的 低分子化合物的由式1-2、1-3、1-4、1-5及1-6所表示的化合物进行筛选的结果示于图7。 纵轴表示W对照作为1的相对翻译精度。与对照相比，5个低分子化合物均显示出使翻译精 度提高约1. 5倍。 阳3側 实施例2 阳369][二次筛选]
[0370] (1)膜岛的制备 阳371]根据文献（GotohM. ,etal.Transplantion, 1987, 43 巧），p725-730)，从膜脏 0 细 胞特异性Cdkall缺失小鼠（参照非专利文献11)分离膜岛。将小鼠在酸麻醉下开胸，剥离 总胆管，缓慢注入胶原酶溶液（320U/mL、西格玛公司制），摘除膨大的膜脏。在37°C的水浴 中消化含有胶原酶的膜脏30分钟后，用吸液管进行分散，使用Ficoll溶液（安玛西亚法玛 西亚公司制）的浓度梯度分离膜岛。将膜岛在用95% 〇2及5%C〇2的混合气体进行了饱和 的林格氏液巧inger'SSolution) (119mM氯化钢、4. 74mM氯化钟、1. 19mM憐酸二氨钢、25mM 碳酸氨钢、IOmM肥阳S、2. 54mM氯化巧、1. 19mM氯化儀、0. 2%BSA)中，在37°C保溫下解育 30分钟。 阳372] 似基于葡萄糖刺激的膜岛素分泌实验 阳37引将一次筛选中呈阳性的低分子化合物分别溶解于DMS0,W终浓度IOmM的方式添 加到含有葡萄糖的林格氏液中，由此准备林格氏液。作为对照，准备仅添加了DMSO的林格 氏液。
[0374] 首先，在低浓度（2. 8mM)葡萄糖林格氏液中培养分离的小鼠膜岛30分钟。然后， 将林格氏液交换为含有低分子化合物的低浓度葡萄糖林格氏液。30分后回收林格氏液，接 着，加入含有低分子化合物的高浓度（16. 7mM)葡萄糖林格氏液。30分后，回收林格氏液。 使用膜岛素检测试剂盒（kt'ス膜岛素-小鼠（S型）、シパ节半公司制）检测释放到林格 氏液中的膜岛素量，根据该试剂盒的操作方法进行检测。 阳375] 将使用上述筛选法对作为分类为横酷脈药的2型糖尿病治疗药的格列本脈和在 一次筛选中呈阳性的乙赃立松进行筛选的结果示于图8。纵轴表示W高浓度葡萄糖刺激下 格列本脈的膜岛素分泌量作为1的相对膜岛素分泌量。乙赃立松显示出仅在高浓度葡萄糖 刺激下促进膜岛素的分泌。此外，在高浓度葡萄糖刺激下，与格列本脈相比，乙赃立松表现 出更加促进膜岛素分泌。 阳376] 将使用上述筛选法对氣西汀进行筛选的结果示于图9。纵轴表示分泌到林格氏液 中的膜岛素的浓度。氣西汀在低浓度葡萄糖刺激下显示出了显著提高膜岛素分泌。 阳377] 实施例3 阳37引[;次筛选] 阳379] 使膜脏0细胞特异性Cdkall缺失小鼠、及野生型小鼠断食一晚后，WImg/kg的 剂量经腹注射乙赃立松。作为对照，分别准备对膜脏P细胞特异性C化all缺失小鼠、及野 生型小鼠经腹注射生理盐水的个体。30分钟后，对所有小鼠WIg/kg的剂量经腹注射葡萄 糖。从葡萄糖给药后开始每隔15分钟进行採血5yL使用Ac州-化eckAVIVANano(罗氏 公司制）测定小鼠血中的血糖值。通过重复测量双因素方差分析（r巧eatedmeasureof two-wayANOVA)进行检验。 阳380] 将通过上述筛选法对乙赃立松进行筛选的结果示于图10。纵轴表示血中的葡萄 糖浓度，横轴表示葡萄糖给药后的经过时间。与生理盐水给药组相比，给药乙赃立松的膜脏 0细胞特异性C化all缺失小鼠显示出血糖值显著降低。
[0381] 实施例4 阳382][由筛选中呈阳性的低分子化合物的长期给药带来的膜脏0细胞特异性Cdkall缺失小鼠的糖耐量改善] 阳383] W1日1次、14天、Img/kg的条件对膜脏0细胞特异性(Mkal1缺失小鼠经腹注射 上述筛选中呈阳性的低分子化合物。作为对照，准备注射了含有DMSO的生理盐水的(Mkall缺失小鼠。从最后给药低分子化合物开始36小时后，对所有小鼠WIg/kg的剂量经腹注射 葡萄糖。从葡萄糖给药后开始每隔15分钟从尾静脉进行採血5yL使用Accu-化eckAVIVA Nano(罗氏公司制）测定小鼠血中的血糖值。通过重复测量双因素方差分析（r巧eated measureoftwo-wayAN0VA)进行检验。 阳384] 将使用上述筛选法对乙赃立松进行筛选的结果示于图11。纵轴表示血中的葡萄糖 浓度，横轴表示葡萄糖给药后的经过时间。与给药DMSO组相比，给药乙赃立松的膜脏0细 胞特异性(Mkall缺失小鼠显示出血糖值显著降低。 阳385] 将使用上述筛选法对氣西汀进行筛选的结果示于图12。纵轴表示血中的葡萄糖浓 度，横轴表示葡萄糖给药后的经过时间。与给药DMSO组相比，给药氣西汀的膜脏0细胞特 异性(Mkall缺失小鼠显示出血糖值显著降低。 阳386] 产业上的可利用性 阳387] 根据本发明，能够针对因膜脏0细胞的Cdkall基因变异导致膜岛素分泌能力降 低的2型糖尿病患者提供新治疗药。因此，在医学界、制药界有用。
【主权项】
1. 一种2型糖尿病治疗剂，含有选自由以下通式（I)、通式（II)和通式（III)所示的 化合物以及它们的医药上可接受的盐组成的组中的一种或两种以上的化合物，式中， R1为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链或 支链的碳数2~4的烯基、及取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基中的任意一 种基团， R2为选自氢、卤素、羟基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~10的烷基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~10的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~10的炔 基、取代或未取代的碳数3~10的脂环基、取代或未取代的碳数6~10的芳基、取代或未 取代的碳数1~10的烷氧基、取代或未取代的碳数1~11的酰基、羧基、及其酯衍生物或 酰胺衍生物、取代或未取代的碳数1~10的磺酰基、以及取代或未取代的碳数1~10的硫 醚基中的任意一种基团， R3为选自氢、卤素、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的 直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基、取代或 未取代的碳数6~10的芳基、及取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷氧基中的任 意一种基团， R4为选自氢、取代或未取代的碳数6~10的芳基、及取代或未取代的碳数6~10的芳 基氧基中的任意一种基团，或者与R5及所键合的碳一同形成羰基， R5为氢，或者与R4及所键合的碳一同形成羰基， R6为选自氢、卤素、取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基、取代或未取代的 直链或支链的碳数2~6的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的炔基、取代或 未取代的碳数3~6的脂环基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基氧基羰基、 取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的烯基氧基羰基、取代或未取代的直链或支链的 碳数2~4的炔基氧基羰基、取代或未取代的碳数6~10的芳基、羧基、及其酯衍生物或酰 胺衍生物、以及氰基、氨基中的任意一种基团， R7为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链或 支链的碳数2~4的烯基、及取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基中的任意一 种基团， R8为选自氢、卤素、取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基、取代或未取代的 直链或支链的碳数2~6的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的炔基、取代或 未取代的碳数3~6的脂环基、取代或未取代的碳数1~4的直链或支链的烷基氧基羰基、 取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的烯基氧基羰基、取代或未取代的直链或支链的 碳数2~4的炔基氧基羰基、取代或未取代的碳数6~10的芳基、羧基、及其酯衍生物或酰 胺衍生物、以及氰基、氨基中的任意一种基团，或者与R9及所键合的碳一同形成羰基， R9为氢，或者与R8及所键合的碳一同形成羰基， Rw为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基、取代或未取代的直链 或支链的碳数2~6的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的炔基、取代或未取 代的碳数3~6的脂环基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基氧基羰基、取代 或未取代的直链或支链的碳数2~6的烯基氧基羰基、取代或未取代的直链或支链的碳数 2~6的炔基氧基羰基、取代或未取代的碳数5~10的芳基、羧基、及其酯衍生物或酰胺衍 生物、以及氰基、氨基中的任意一种基团， Rn为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基、取代或未取代的直链 或支链的碳数2~6的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的炔基、及取代或未 取代的碳数3~6的脂环基中的任意一种基团、 此外，Rw与R 11可以与它们所键合的氮原子一同构成取代或未取代的含氮杂环；式中， R21为选自氢、取代或未取代的碳数6~10的芳基、及取代或未取代的碳数6~10的 重氢化芳基中的任意一种基团， R22为选自取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链或支 链的碳数1~4的重氢化烷基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4 的炔基、及取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化炔基中的任意一种基团， R23为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链或 支链的碳数1~4的重氢化烷基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或 未取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~ 4的炔基、及取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化炔基中的任意一种基团， X为亚甲基或重氢化亚甲基；式中， R31为选自取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链或支 链的碳数1~4的重氢化烷基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4 的炔基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的重氢化炔基、取代或未取代的5~6元 环的杂环基、取代或未取代的碳数6~10的芳香族基、取代或未取代的碳数2~10的含氮 芳香族基、磺酸基、及磺酰基中的任意一种基团， R32为选自氢、羟甲基、及碳上的氢被重氢取代的羟甲基中的任意一种基团， R33为选自取代或未取代的直链或支链的碳数1~6的烷基、取代或未取代的直链或支 链的碳数1~6的重氢化烷基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的烯基、取代或未 取代的直链或支链的素数2~6的重氢化烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的 炔基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~6的重氢化炔基、及取代或未取代的碳数3~ 6的脂环基中的任意一种基团， R34为氢、羟甲基或碳上的氢被重氢取代的羟甲基， R35为选自氢、羟基、取代或未取代的5~6元环的含氮杂环基、及取代或未取代的碳数 2~10的含氮芳香族基中的任意一种基团， R36为选自氢、羟基、及卤素中的任意一种基团，Y为选自亚甲基、重氢化亚甲基、及羟基 亚甲基中的任意一种基团。2. 根据权利要求1所述的2型糖尿病治疗剂，其特征在于，化合物为以下式（I-I)~ (1-6)、式（II-I)、式（II-2)及式（III-I)所示的化合物以及它们的医药上可接受的盐，3. 根据权利要求1或2所述的2型糖尿病治疗剂，其中，医药上可接受的盐是与选自盐 酸、硝酸、硫酸、碳数1~10的磺酸、取代或未取代的碳数1~6的烷基羧酸、及取代或未取 代的碳数4~8的二羧酸中的任意一种酸所形成的盐。4. 根据权利要求3所述的2型糖尿病治疗剂，其中，医药上可接受的盐是与选自盐酸、 硝酸、甲磺酸、乙酸、乙酰丙酸、乳酸、氟联苯丙酸、苯酮苯丙酸、乙二酸、富马酸、及马来酸中 的任意一种酸所形成的盐。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的2型糖尿病治疗剂，其中，2型糖尿病是因 Cdkall基因变异导致胰岛素分泌能力降低的2型糖尿病。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的2型糖尿病治疗剂，其特征在于，其活化从胰岛 素原向胰岛素的转变。7. -种化合物，其特征在于，由以下通式（IV)表示，式中， R41为选自氢、卤素、羟基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基、 及取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷氧基中的任意一种基团， R42为选自氢、卤素、羟基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基、 及取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷氧基中的任意一种基团， R43为选自氢、卤素、羟基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未 取代的直链或支链的碳数2~4的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基、 及取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷氧基中的任意一种基团， R44为选自氢、羧基、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、及取代或未取代 的碳数6~10的芳基中的任意一种基团， R45为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链 或支链的碳数2~4的烯基、及取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基中的任意 一种基团， R46为选自氢、取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基、取代或未取代的直链 或支链的碳数2~4的烯基、取代或未取代的直链或支链的碳数2~4的炔基、取代或未取 代的碳数5~10的芳基、以及由取代或未取代的直链或支链的碳数1~4的烷基和取代或 未取代的碳数5~10的芳基构成的芳基烷基中的任意一种基团， 此外、R45和R46可以与它们所键合的氮原子一同构成取代或未取代的含氮杂环。8. 根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，通式（IV)所示的化合物为以下的式 (IV-I)~（IV-4)，
【专利摘要】本发明的课题在于，针对原因之一为Cdkal1基因发生了变异的胰脏β细胞中因tRNALys(UUU)的修饰异常导致胰岛素合成异常的2型糖尿病患者，提供新治疗药。使用下述筛选系统发现由以下式(I)～(III)表示的化合物能够成为因Cdkal1基因变异导致胰岛素分泌能力下降的2型糖尿病患者的治疗药，所述筛选体系为：(1)使用了蛋白质翻译时发生了错译、阅读框错位时荧光素酶被正确翻译的大肠杆菌的筛选系统、(2)使用了由胰脏β细胞特异性Cdkal1缺失小鼠分离的胰脏胰岛的筛选系统、(3)使用了胰脏β细胞特异性Cdkal1缺失小鼠的筛选系统。
【IPC分类】A61K31/138, A61K31/495, A61K31/47, A61P3/10, A61K31/4453, C12N15/09, A61K31/135, A61K31/496, C07D211/58, C07D295/10
【公开号】CN105188692
【申请号】CN201480018572
【发明人】富泽一仁, 魏范研, 井上谦吾, 大川原正
【申请人】国立大学法人熊本大学, 学校法人银杏学园熊本保健科学大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年3月28日
【公告号】US20160060235, WO2014156196A1