解的测试 依照Nishida等人的方法，通过与实施例1中相同的方法，将原代角膜细胞用于评价测 试化合物对=维胶原凝胶降解的抑制作用。
[0074] 如实施例1中，使原代角膜细胞生长且与培养载玻片脱离。在洗涂后，制备细胞悬 浮液。将所得到的悬浮液（1.1XIO7细胞/孔MEM)、I型胶原溶液（5mg/ml)、10XMEM重构缓冲液和水在冰上W0. 2:7:1:1:1. 8 (体积比）进行混合。用0. 5ml该混合物接种涂 布有1%BSA的培养皿，所述培养物在37°C下溫育一小时，W制备胶原凝胶。
[007引在制备凝胶后，通过将含RAR丫激动剂A(R667)的二甲亚讽溶液（1nM)、含RAR丫 激动剂B(CD437)的二甲亚讽溶液（1nM、10nM)、含RAR丫激动剂C(BMS961)的二甲亚讽 溶液（10nM)或作为对照的无RAR丫激动剂二甲亚讽溶液，化及作为刺激剂的10ng(最终 浓度10ng/ml)比-1 0 (产品编号201-LB-005 ;R&DSystems)和60嗦（最终浓度60嗦/ ml)纤溶酶原(产品编号P9156,SigmaAl化ich)加入MEM培养基中，并且在先前制备的胶 原凝胶上叠加培养基，开始培养(在37°C和5%C02的条件下)。
[0076] 在培养48小时后，使胶原水解，并且通过与实施例1相同的方法测量翔捕氨酸量， 所述径脯氨酸是胶原降解产物，W评价每种RARy激动剂抑制胶原降解的作用。结果显示 于图4中。
[0077] 在该测试中，不仅RAR丫激动剂A，而且RAR丫激动剂B和C均显示出抑制角结膜 胶原降解的作用。
[007引 实施例4 (测试实施例）通过RAR丫激动剂抑制MMP-1、2、3和9的表达和活化的测试 认为蛋白酶即基质金属蛋白酶(MMP)的分泌或表达与I型胶原的降解相关。在运点上， 研究通过RAR丫激动剂的MMP-1、2、3和9的表达和活化抑制。
[0079] 由正常兔眼球收集的原代角膜细胞在无血清MEM培养基中培养24小时。将RAR丫 激动剂（R667) (R667 浓度：1 X 1〇6剛、1 X 1〇5剛、1 X 1〇4剛、1 X 1〇3剛、1 X 102140加入所获得的培养溶液中，并且执行12小时的预处理。作为阳性对照，添加10 nM 其为合成类固醇的地塞米松（Dex),并且类似地执行预处理。随后，加入IL-10 (0.1 ng/ ml)用于刺激，并且在24小时后收集上清液。对收集的培养溶液使用下述蛋白质印迹分析 和明胶酶谱分析。
[0080] (蛋白质印迹分析） 在使用10%聚丙締酷胺凝胶的SDS-PAGE中，使收集的培养溶液的上清液展开后，将分 离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤器上。随后，将硝酸纤维素滤器上的非特异性位点阻断，并 且在 4°C下与抗人MMP-I抗体（R&DSystems)或抗兔MMP-3 抗体（DaiichiFineQiemical Co.，Ltd) -起溫育24小时。使用E&?试剂（GEHealthcare)进行检测。
[0081] 结果显示于图4A中。无活性PRO-MMP-I、PR0-MMP-3W及活性MMP-I、MMP-3各自 的条带均减弱，其中其量依赖于RAR丫激动剂A的浓度。因此，掲示RAR丫激动剂A浓度依 赖性地抑制MMP-I和MMP-3的表达和活化。
[0082] (明胶酶谱分析） 在使用含有0. 1%明胶的10%聚丙締酷胺凝胶的SDS-PAGE上，使收集的培养溶液的上 清液展开后，将它与含有2. 5%TritonX-IOO的TBS溶液一起在室溫下溫育一小时。溫育 后的凝胶用考马斯亮蓝（WakoPure化emicalImlustries,Ltd)溶液染色，并且用5%甲 醇-7. 5%乙酸溶液（化calaiTesque,Inc)脱色。
[0083] 结果显示于图4B中。无活性PR0-MMP-2、PR0-MMP-9W及活性MMP-2、MMP-9各自 的条带均减弱，其中其量依赖于RAR丫激动剂A的浓度。因此，掲示RAR丫激动剂A浓度依 赖性地抑制MMP-2和MMP-9的表达和活化。
[0084] 实施例5 (测试实施例）用RAR丫激动剂A抑制角膜混浊和溃瘍的测试 通过氯胺酬和赛拉嗦的混合物溶液的肌内施用，将全身麻醉应用于雄性日本白兔(体 重2. 5-3. 5kg，27只兔)。随后，通过0.4%盐酸奥布卡因滴注剂实施局部麻醉。此外，将30 1%LPS(SigmaAl化ich)注射到一只眼的角膜基质内，而另一只眼则不注射。
[0085] 通过使用微量吸管，在LI^注射当天的注射后，将50W含有RAR丫激动剂A (R667 :0. 1%，24ml)的0. 1%PBS/0. 1%聚山梨醇醋80溶液滴注施用于用LI^注射了的兔 两次，并且其后每天四次直至第10天。作为对照，类似地施用不含RAR丫激动剂A的0.1% PBS/0. 1%聚山梨醇醋80溶液(介质）。图5显示对照和其中施用RAR丫激动剂A的情况的 代表性例子。
[0086] 在图5中，在顶部行中所示的对照(介质）中，观察到角膜混浊和溃瘍。然而，在底 部行中所示的其中施用RAR丫激动剂A(0.1%R667)的情况下，未观察到角膜混浊和溃瘍。 因此，掲示RAR丫激动剂A抑制角膜混浊和溃瘍。
[0087] 工业可应用性 其为本发明的角结膜病症治疗剂的有效成分的RARy激动剂，通过强力抑制胶原降 解，可用于预防角结膜病症或用作角结膜病症的治疗剂，所述角结膜病症例如为角膜溃瘍、 角膜上皮磨损、角膜炎、干眼症、结膜炎、慢性浅层角膜炎、角膜糜烂、持续性角膜病症、浅层 点状角膜病变、角膜上皮缺损、结膜上皮缺损、干燥性角结膜炎、上缘角结膜炎、丝状角结 膜炎、传染性角膜炎、非传染性角膜炎、传染性结膜炎和非传染性结膜炎。进一步地，所述 RAR丫激动剂通过强力抑制胶原收缩，也可用作与角结膜病症相关的角膜癒痕或结膜癒痕 的治疗剂。
【主权项】
1. 角结膜病症的治疗剂，其包含RARy激动剂作为有效成分。2. 权利要求1的治疗剂，其中所述RARy激动剂是（E)-4-(2-{3-[(IH-吡唑-1-基） 甲基]-5, 5, 8, 8-四甲基-5, 6, 7, 8-四氢萘-2-基}乙烯基）苯甲酸、6-[3-(1_金刚烷 基）-4-羟苯基]-2-萘甲酸、3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢 萘-2-基）乙酰基氨基]苯甲酸、其酯或其盐。3. 权利要求1或2的治疗剂，其中所述角结膜病症选自角膜溃疡、角膜上皮磨损、角膜 炎、干眼症、结膜炎、慢性浅层角膜炎、角膜糜烂、持续性角膜病症、浅层点状角膜病变、角膜 上皮缺损、结膜上皮缺损、干燥性角结膜炎、上缘角结膜炎、丝状角结膜炎、传染性角膜炎、 非传染性角膜炎、传染性结膜炎、非传染性结膜炎、角膜瘢痕和结膜瘢痕。4. 根据权利要求1-3中任一项的治疗剂，其中施用形式是滴注施用或口服施用。5. 根据权利要求1-4中任一项的治疗剂，其中剂型为滴注剂、眼用软膏、注射剂、片剂、 颗粒剂、细粒剂、粉末剂或胶囊剂。
【专利摘要】本发明解决了提供用于角结膜病症的新型治疗剂的问题。作为解决该问题的手段，提供了含有RARγ激动剂作为活性成分的用于角结膜病症的治疗剂。治疗剂在角结膜病症模型中显示出极佳的改善作用，并且因此可用作角结膜病症的治疗剂，所述角结膜病症例如角膜溃疡、角膜上皮磨损、角膜炎、干眼症、结膜炎、慢性浅层角膜炎、角膜糜烂、持续性角膜病症、浅层点状角膜病变、角膜上皮缺损、结膜上皮缺损、干燥性角结膜炎、上缘角结膜炎、丝状角结膜炎、传染性角膜炎、非传染性角膜炎、传染性结膜炎和非传染性结膜炎。治疗剂也可用作与角结膜病症相关的角膜结瘢和结膜结瘢两者的治疗剂。
【IPC分类】A61P27/14, A61P27/04, A61K45/00, A61K31/415, A61P27/02
【公开号】CN105188753
【申请号】CN201380069723
【发明人】木村和博
【申请人】国立大学法人山口大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2013年11月7日
【公告号】CA2890424A1, EP2918290A1, EP2918290A4, US20150290172, WO2014073209A1