一种纯种发酵制备六神曲的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域和中药材生产领域，特别涉及一种采用单一菌株一一产 黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)纯种发酵制备中药六神曲的方法。
【背景技术】
[0002] 六神曲（Medicated Leaven Massa)又名神曲、六曲，是常用的消食类药物之一，是 由青蒿、苍耳草、辣寥自然汁拌以苦杏仁粉、赤小豆粉、麦麸及面粉，按比例混合，在适宜条 件下发酵而成，是传统发酵曲剂中应用最广泛的一种。六神曲味甘、辛，性温，归脾、胃经；具 有消食健胃、和中止泻之功效。
[0003] 传统制备六神曲的工艺是在自然条件下，在特定的季节，利用天然存在的微生物 菌种进行发酵，由于全国各地发酵环境不同，发酵季节时令的差异，造成不同产地产品或相 同产地不同批次的产品差异较大，或者引入杂菌如黄曲霉毒素，而严重影响六神曲的使用 安全。因此，规范六神曲发酵方法具有重要意义。
[0004] 本课题组先期从传统工艺发酵的六神曲中分离得到有效的发酵菌株，并首次对其 进行了微生物学鉴定，确定为：产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)，并将其应用于纯 种发酵制备六神曲的中药材生产中。此方法减少了杂菌污染，产品工艺可控、质量可控，操 作简单，六神曲疗效得以保证，为规范六神曲发酵工艺提供科学依据，并且在生产中提高经 济效益。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种六神曲纯种发酵的菌株，为：产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)〇
[0006] 本发明的目的之二是提供一种采用纯种发酵制备六神曲的方法。
[0007] 本发明的目的之三是提供一种以产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)为发酵 菌种，纯种发酵制备六神曲的方法。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明提供的适用于纯种发酵制备六神曲的产黄青霉菌菌株来源于以下方法：
[0010] 1、采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵六神曲分离得到3株真菌， 使用生物显微镜进行显微形态学鉴定，DNA测序进行分子生物学鉴定，确定3株真菌分 别为曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)，青霉属真菌产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)以及枝抱属真菌枝抱霉菌（Cladosporium cladosporioides) 〇
[0011] 真菌的鉴定
[0012] 采用真菌鉴定通用引物ITS4与ITS5,对六神曲中分离的真菌基因组DNA进行序列 扩增。
[0013] 50 μ L反应体系如下：
[0014]
[0015] 循环参数设定：
[0016] 95°(：预变性5!1^11，95°(：变性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸11^11，30个循环，最后 72°C延伸 IOmin。
[0017] 反应结束后，取扩增后产物5 μ L，经电场强度为5V/cm，1. 0%琼脂糖凝胶电泳，电 泳时间1小时，在紫外灯下检测目的条带与预期是否相符。
[0018] 将PCR扩增出来的目的基因片断测序，所测得序列提交至NCBI，与Gene Bank数 据库中已知基因序列进行Blast对比，选取相似性大于99%，且种属地位明确的序列，应用 Clustal XI. 83进行多序列对比，同时使用软件MEGA5. 0构建系统进化树。此菌有鉴定意义 的序列是 FJ176474. 1、JF440603. UAM948960. 1 以及 JF834167. 1，其中与 JF834167. 1 同源 性最高（Blast 的 Max ident 为 100% )。
[0019]
[0020] 此外，微生物鉴定委托中国科学院微生物研究所进行进一步检验鉴定，并出具鉴 定报告，报告编号：（2013)微检字第240号，鉴定结论为：在本实验室条件下，根据送检结果 的培养特征、显微特征以及rRNA基因序列等实验数据综合分析，送检菌种（菌株编号：SQ2) 的鉴定结果为：产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)。
[0021] 2、以单一菌株发酵替代六神曲原有自然发酵，观察发酵后的气味及外观性状，其 中产黄青霉菌发酵的六神曲气味纯香，表面黄衣出现与传统发酵一致；枝孢霉菌发酵六神 曲产生霉腐气味，曲块表面暗灰褐色与传统发酵差别大，推测枝孢霉菌为六神曲发酵中产 生的杂菌，而产黄青霉菌为适合六神曲纯种发酵的有效菌种。
[0022] 3、考察产黄青霉菌发酵六神曲95%乙醇提取物对8种肠道致病菌的抑制作用，结 果表明，产黄青霉菌六神曲提取物对肠道致病菌具有显著抑制作用。通过ELISA试剂盒检 测米曲霉菌及产黄青霉菌六神曲中黄曲霉毒素 Bl含量，得米曲霉菌发酵六神曲中黄曲霉 毒素 Bl含量为14. 25 μ g/kg，含量超标；产黄青霉菌发酵六神曲中黄曲霉毒素 Bl含量为 1. 63 μ g/kg，符合含量限制要求。
[0023] -种纯种发酵制备六神曲的方法，其特征在于以单一发酵菌种，以六种原料包括： 面粉（和或麦麸）、赤小豆、苦杏仁、青蒿、辣寥、苍耳草制成培养基，在适宜的条件下，发酵 而成六神曲药材。
[0024] -种用于纯种发酵制备六神曲的微生物菌种，其特征在于所述菌株为产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)〇
[0025] -种以产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)为发酵菌种，纯种发酵制备六神 曲的方法。
[0026] -种以产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)纯种发酵制备六神曲的方法，其 特征在于如下步骤：
[0027] 称取一定量的青蒿、苍耳草及辣寥制汁，用作制取发酵软材的粘合剂；称取麦 麸、面粉，二者的配比为1 : 5~5 : 1，加入占麦麸和面粉混合物重量比3~7%的苦 杏仁粉，再加入占麦麸和面粉混合物重量比3~7%的赤小豆粉，以上材料混合均匀共同 组成发酵所需的固体培养基，提供发酵所需的碳源、氮源；将产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)菌种按每100g混合固体培养基加入1~5g菌种的比例拌入固体培养基中， 混合均匀制成软材，再制成曲块，置于28~32°C恒温条件下，湿度70~80%，培养5~10 天，至表面遍布黄衣，停止发酵，取出，切成约Icm 3大小的曲块，烘干，即得纯种发酵的六神 曲。
[0028] 本发明中六神曲的制备方法，与现市售六神曲的制备存在明显不同。本方法采用 直接发酵法，将青蒿、苍耳及辣寥水制汁后，置于面粉和（或）麦麸、苦杏仁粉及赤小豆粉混 合制成的培养基中，将通过生物技术分离得到的产黄青霉菌接种后进行发酵，规定了确切 的发酵时间、发酵温度，减少了杂菌污染，简化了操作。该方法所制备的六神曲保存了传统 六神曲的特色，改进了传统发酵的不足，新法的发酵品可以更好地发挥药效，对常见人体致 病菌具有显著地抑菌、杀菌活性，而发挥消食作用，而且该方法适合工业化的大生产。
【附图说明】
[0029] 图1为黄曲霉毒素 Bl的标准曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
[0031 ] 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032] 实施例一：产黄青霉菌实验室发酵制备六神曲
[0033] 称取干青蒿、干苍耳、干辣寥各25g，加入10倍量，8倍量，6倍量蒸馏水煎煮三次， 每次40min，合并水煎液，浓缩至250mL，转移至500mL灭菌锥形瓶中，密封，置于洁净工作 台中放凉，备用。
[0034] 称取麦麸500g、面粉500g、苦杏仁粉和赤小豆粉各40g，盛装于1000 mL烧杯中， 将八层纱布置于牛皮纸中间，密封烧杯口，于103. 4kPa、121. 3°C，高压蒸汽灭菌器内灭菌 20min，灭菌结束后立即取出，转移至洁净工作台中放凉，备用。
[0035] 将以上处理过的药汁及20g产黄青霉菌体拌入无菌培养基中，混合均匀，制成直 径约12cm，厚度约Icm圆饼状，盛装于灭菌后的18cm 口径培养皿中，倒置于28°C恒温箱中， 相对湿度为70 %，培养7天，至有黄衣出现，停止发酵，取出，切成约I cm3大小曲块，烘干，收 取贮存，注意防虫蛀。
[0036] 实施例二：产黄青霉菌生产制备六神曲
[0037] 称取新鲜的青蒿、苍耳、辣寥各5kg，榨取鲜汁，作为粘合剂备用。
[0038] 称取麦麸30kg、面粉20kg、苦杏仁粉和赤小豆粉各2kg，将以上处理过的鲜汁及 100g产黄青