br>[0034] 结果如图1所示，补骨脂95%乙醇提取物对hES2呈现出强抑制活性，该反应体系 下羧酸酯酶残余活性小于10%。
[0035] 实施例2
[0036] 补骨脂提取物抑制羧酸酯酶主要成分的鉴定
[0037] 借助高效液相色谱仪，将中药补骨脂提成分进行分离，并每隔30秒对分离液进行 收集，将其加入到人肝微粒体体外孵育体系，以荧光素二乙酸酯的水解代谢为探针反应，测 定上述指纹图谱各个接取时间段对羧酸酯酶抑制活性，并通过质谱鉴定有抑制活性的补骨 脂成分。
[0038] (1)中药补骨脂在95 %乙醇（0.3g/ml)超声3小时提取，高速冷冻离心机， 20, 000 X g、4°C的条件下，高速离心20分钟后，取上清。
[0039] (2)采用的色谱条件为：ODS 色谱柱（VP-0DS-C18, 150L*2. 0mm，SHIMADZU)，以甲醇 (A)和水（B)为流动相，检测波长为285nm，25分钟对其进行梯度洗脱，水相（B)从60%到 10%。每隔30秒将收集馏分进行连续收集，在40°C恒温干燥箱中烘干。
[0040] (3)以荧光素二乙酸酯水解代谢为探针反应，借助人肝微粒体体外孵育体系，测定 上述指纹图谱各个时间点接取组分对羧酸酯酶抑制活性。具体操作如下：
[0041] a. 150微升体外代谢反应体系中，含有pH7. 4的磷酸缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度 为2 μ g/ml，于37 °C条件下震荡预孵10分钟；
[0042] b.向反应体系中加入底物（终浓度10 μ M)，起始反应；于37°C条件下反应30分 钟后，加入150 μ 1含有乙腈,终止反应；
[0043] c.对反应体系进行酶标仪检测分析；对水解代谢产物进行定量检测。
[0044] 如图2所示，补骨脂提取物中对hCE2抑制活性小于20 %的物质有5个，通过 HPLC-MS/MS检测分析，将对羧酸酯酶有抑制活性成分进行鉴定。鉴定结果如表1，补骨脂 中对羧酸酯酶有抑制活性的成分依次为：新补骨脂异黄酮、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲 醚、补骨脂甲素 A、补骨脂酚。
[0045] 表1.补骨脂提取物中对羧酸酯酶2有强烈抑制能力的化合物
[0047] 实施例3
[0048] 补骨脂化学成分单体对羧酸酯酶抑制能力的定量评估
[0049] 以对荧光素二乙酸酯的水解代谢为探针反应，借助人肝微粒体体外孵育体系，测 定不同补骨脂提取物对羧酸酯酶抑制的IC 5。，具体实验流程如实施例2所述：
[0050] 表2补骨脂化学成分单体对羧酸酯酶2的抑制能力IC50
[0053] a. 200微升体外代谢反应体系中，含有pH7. 4的磷酸缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度 为2 μ g/ml，抑制剂终浓度范围为1 μ Μ-80 μ M，于37°C条件下震荡预孵10分钟；
[0054] b.向反应体系中加入底物（终浓度10 μ M)，起始反应；于37°C条件下反应30分 钟后，加入200 μ 1乙臆，剧烈震汤后，终止反应；
[0055] c.采用高速冷冻离心机，在20, OOOXg的条件下，高速离心上述体系5分钟后，取 上清，进行酶标仪检测分析；对水解代谢产物进行定量检测。
[0056] 该类化合物对hCE2呈现出强抑制活性，各化合物的半数抑制浓度如表2所示，从 中可以看出补骨脂类系列化合物对羧酸酯酶有较强的抑制活性，且多数化合物的抑制活性 优于BNPP。通过Lineweaver - Burk及Dixon作图均显示该类化合物是羧酸酯酶的非竞争 性抑制剂。
[0057] 实施例4
[0058] 补骨脂提取物对减缓伊立替康导致的小鼠腹泻研究
[0059] 18只Balb/c小鼠随机分为3组：正常对照组、伊立替康腹泻模型组和补骨脂+伊 立替康腹泻模型组（以下简称补骨脂组），每组各6只。分别观察正常对照组、腹泻模型组 和补骨脂组小鼠的腹泻状况，并对小鼠肠道组织进行组织切片检查。腹泻模型组按Trifan 方法（Cancer Res2002 ;62:5778-84.)，腹泻模型采用腹腔注射伊立替康（100mg/kg/d)，连 续用药3天（d)，迟发性腹泻于第3天出现，于第4天最严重。补骨脂组于CPT-Il
[0060] 注射前3天开始，每天1次，灌胃5g/kg水煎剂，其余两组用等体积蒸馏水灌胃来 防止应急对小鼠造成的影响。正常对照组尾静脉注射等体积生理盐水。分别观察正常对照 组、腹泻模型组和补骨脂酮组小鼠的腹泻状况，于第7天处死小鼠，进行肠道组织取材，组 织切片染色检查。
[0061] 注射CPT-Il后第9天处死小鼠，距回盲瓣5cm处取回肠3cm、盲肠1cm、肛门至上 7~9cm取结肠组织3cm，10%甲醛固定，以备光镜观察。常规HE染色观察各组小鼠肠粘膜 组织结构变化；根据Chiu肠粘膜损伤评分方法（Arch Surgl970 ;101:478-83)，对肠粘膜损 伤程度进行分级：1级：正常肠粘膜绒毛；2级：上皮下间隙扩大，通常在肠绒毛顶端，常有 上皮充血；3级：上皮下间隙扩张，伴有中等程度上皮层从肠粘膜固有层脱离；4级：肠粘膜 侧面大块上皮脱离，大部分肠绒毛顶端变光滑；5级：肠绒毛变光滑，毛细血管扩张，肠粘膜 固有层细胞构成增加；6级：肠粘膜固有层消化和分解，出血和出现溃疡。
[0062] 实验结果显示，腹泻程度显著下降。对肠粘膜损伤程度进行评估如表2所示，补骨 脂组肠粘膜损坏程度较模型组轻微。
[0063] 表3.小鼠盲肠肠粘膜损伤程度分级η (% )
[0065] Η&Ε染色的结果如图3所示，正常小鼠小肠粘膜表皮层比较完整，而CPT-11能造成 小鼠小肠粘膜细胞的凋落，并造成腺体的不完整，而补骨脂则能明显改善该毒性反应。图中 A为正常组；B为模型组；C为模型+补骨脂组（5g/kg)。
[0066] 以上实验结果证实，补骨脂不仅能够降低CPT-Il诱发的小鼠迟发性腹泻及肠粘 膜损伤的程度，还能有效抑制腹泻的发生。因此，补骨脂对CPT-Il诱发的小鼠迟发性腹泻 具有预防作用。
【主权项】
1. 补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用，其特征在于：补骨脂提 取物或其单体化学成分可作为人羧酸酯酶抑制剂，用于缓解临床多种化疗药物导致的迟发 型腹泻或提高酯类药物的生物利用度并延长其代谢半衰期。2. 按照权利要求1所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用， 其特征在于所述的补骨脂提取物为25% -95%乙醇提取物；补骨脂提取物主要单体化学成 分为：新补骨脂异黄酮、补骨脂乙素、补骨脂甲素A、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚、补骨 脂二氢黄酮或异补骨脂二氢黄酮。3. 按照权利要求1或2所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应 用，其特征还在于所述羧酸酯酶抑制剂可以上述任一补骨脂化学成分的单体成分使用，或 多种单体的药物组合物形式使用，或以补骨脂提取物的中药制剂形式使用。4. 按照权利要求1所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用， 其特征在于所述的药物组合物，包含药学可接受的载体，以及新补骨脂异黄酮、补骨脂乙 素、补骨脂甲素A、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂二氢黄酮中 的任意一种或多种组合。5. 按照权利要求1所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用， 其特征在于所述的补骨脂提取物中药制剂，包含药学可接受的载体，及补骨脂提取物或部 分纯化物，其可制成片剂、胶囊、滴丸等制剂。6. 按照权利要求1所述的补骨脂提取物或其单体作为人羧酸酯酶抑制剂的应用，其 特征在于所述的化疗药物包括但不限于以下药物：盐酸伊立替康、顺钼、5-氟尿嘧啶、紫杉 醇、拓扑替康、甲氨蝶呤、阿霉素、依托泊苷、环磷酰胺、卡莫司汀、吉西他滨、表柔比星或长 春瑞滨。7. 按权利要求1或2所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的 应用，其特征在于补骨脂提取物或其单体化学成分作为人羧酸酯酶抑制剂，用于缓解临床 抗癌药物伊立替康导致的迟发型腹泻或提高酯类药物的生物利用度并延长其代谢半衰期 时，所用补骨脂提取物中活性成分总黄酮类化合物与抗癌药物伊立替康的摩尔比为2~ 100:1。8. 按权利要求7所述的补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用，其 特征在于所用补骨脂单体成分或其组合物与抗癌药物伊立替康的摩尔比为2~50:1。
【专利摘要】一种补骨脂提取物或其单体成分作为人羧酸酯酶抑制剂的应用属医药技术领域。本发明具体内容为：补骨脂提取物或其单体化学成分作为人羧酸酯酶抑制剂，用于缓解临床多种化疗药物导致的迟发型腹泻或提高酯类药物的生物利用度并延长其代谢半衰期。所述的补骨脂提取物为25％-95％乙醇提取物；补骨脂提取物主要单体化学成分为：新补骨脂异黄酮、补骨脂乙素、补骨脂甲素A、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚、补骨脂二氢黄酮或异补骨脂二氢黄酮。本发明体外活性测定发现补骨脂提取物或其单体抑制羧酸酯酶的IC50在0.8-6.4微摩，且该类化合物的安全性较好，提示该类化合物具有良好的应用前景。
【IPC分类】A61K31/05, A61K31/4745, A61P1/12, A61K31/12, A61K31/37, A61K31/352, A61K36/487, A61P35/00
【公开号】CN105267293
【申请号】CN201410360605
【发明人】杨凌, 李耀光, 葛广波, 李世阳, 刘兆明, 吕侠
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月24日