含灵芝和银杏叶的中药组合物用于中风后促进康复的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药技术领域，具体涉及一种含灵芝和银杏叶的中药组合物用于中风 后促进康复的应用。
【背景技术】
[0002] 中风，中医病名，有外风和内风之分，外风因感受外邪（风邪）所致，在《伤寒论》名 曰中风（亦称桂枝汤证）；内风属内伤病证，又称类中风，脑卒中，卒中，风痱。现代一般称 中风多指内伤病证的类中风，多因气血逆乱、脑脉痹阻或血溢于脑所致。以突然昏仆、半身 不遂、肢体麻木、舌蹇不语，口舌歪斜，偏身麻木等为主要表现的脑神疾病，并具有起病急、 变化快，如风邪善行数变的特点。
[0003] 发明人经实验探索发现一种含灵芝和银杏叶的中药组合物用于制备中风后促进 康复的药物的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种含灵芝和银杏叶的中药组合物在制备中风后促进康复 的药物中的应用。
[0005] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0006] -种含有灵芝和银杏叶的中药组合物在制备中风后促进康复的药物中的应用，其 中，该组合物由以下重量份的组分制成：
[0007] 灵芝300-400重量份银杏叶300-400重量份淮牛膝200-290重量份
[0008] 玄参200-290重量份石昌蒲150-190重量份天麻 100-140重量份
[0009] 上述组合物优选由以下组分制成：
[0010] 灵芝300-350重量份银杏叶300-350重量份淮牛膝250-290重量份
[0011] 玄参250-290重量份石昌蒲150-180重量份天麻 110-140重量份
[0012] 上述组合物最优选由以下组分制成：
[0013] 灵芝333重量份银杏叶333重量份淮牛膝278重量份
[0014] 玄参278重量份石菖蒲167重量份天麻125重量份
[0015] 上述中药组合物可与药学上允许的辅料制成药学规定的剂型，所述的剂型优选为 胶囊剂。
[0016] 该组合物的制备方法包括以下步骤：
[0017] a、将石菖蒲粉碎成颗粒；
[0018] b、将石菖蒲颗粒采用CO2超临界萃取，萃取压力为22_30Mpa，萃取釜温度为 45-60°C，萃取时间为0. 5-1. 5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物；
[0019] c、取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液；另取挥发油重量4-8倍量 的β-环糊精，用β-环糊精3-5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加上述挥发油 乙醇溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，0-4 °C冷藏静置24小时以上，滤过，于40-80°C真空干 燥，即得挥发油包合物；
[0020] d、灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药材6-10倍 重量浓度为70-90%的乙醇，加热回流提取1-3次，每次1-2小时，提取液合并，静置，滤过， 滤液减压回收乙醇，浓缩至60°C条件下相对密度为1. 15~1. 30的清膏；
[0021] e、将清膏在60_80°C减压干燥，得干膏；
[0022] f、将干膏和挥发油包合物混合均匀。
[0023] 上述组合物的制备方法优选包括以下步骤：
[0024] a、将石菖蒲粉碎成颗粒；
[0025] b、将石菖蒲颗粒采用CO2超临界萃取，萃取压力为22_30Mpa，萃取釜温度为 45-60°C，萃取时间为0. 5-1. 5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物；
[0026] c、取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液；另取挥发油重量4-8倍量 的β-环糊精，用β-环糊精3-5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加上述挥发油 乙醇溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，0-4 °C冷藏静置24小时以上，滤过，于40-80°C真空干 燥，即得挥发油包合物；
[0027] d、灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药材6-10倍 重量浓度为70-90%的乙醇，加热回流提取1-3次，每次1-2小时，提取液合并，静置，滤过， 滤液减压回收乙醇，浓缩至60°C条件下相对密度为1. 15~1. 30的清膏；
[0028] e、将清膏与清膏重30-40%的微晶纤维素混合，置60°C -80°C条件下减压干燥，得 干膏；
[0029] f、将干膏和挥发油包合物粉碎成细粉，与清膏重5-55%的微晶纤维素和干膏重 〇. 5%硬脂酸镁混合均匀，得细粉。
[0030] 所述的中风后遗症表现为半身不遂，肢体无力，口舌歪斜，言语謇涩，智能减退，口 角流涎。
[0031] 上述含有灵芝和银杏叶的中药组合物在制备益气养阴活血、化痰通络醒脑的药物 中应用，其中，该组合物由以下重量份的组分制成：
[0032] 灵芝300-400重量份银杏叶300-400重量份淮牛膝200-290重量份
[0033] 玄参200-290重量份石昌蒲150-190重量份天麻 100-140重量份。
[0034] 上述组合物优选由以下组分制成：
[0035] 灵芝300-350重量份银杏叶300-350重量份淮牛膝250-290重量份
[0036] 玄参250-290重量份石昌蒲150-180重量份天麻 110-140重量份。
[0037] 上述组合物最优选由以下组分制成：
[0038] 灵芝333重量份银杏叶333重量份淮牛膝278重量份
[0039] 玄参278重量份石菖蒲167重量份天麻 125重量份。
[0040] 与现有技术比较本发明的有益效果：
[0041] 本发明含灵芝和银杏叶的中药组合物治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所 致脑损伤具有显著的的保护作用；对于治疗大鼠大脑中动脉闭塞所致永久性脑缺血具有显 著的保护作用；对PAF、ADP诱导家兔血小板聚集有显著的抑制作用；对血栓形成具有显著 的抑制作用；能显著延长小鼠出血时间和凝血时间。
[0042] 另外，本发明中药组合物能对连二亚硫酸钠（Na2S204)合并缺糖致体外皮层神经 元细胞缺氧缺糖损伤模型起到很好的保护作用；能对血小板活化因子（PAF)致皮层神经元 细胞氧化应激损伤模型的保护作用明显。本发明中药组合物含药血清治疗给药对体外培养 皮层神经元具有显著的保护作用。
[0043] 以下通过试验例对中风后促进康复进行具体说明。采用的试验样品简称复方银灵 通胶囊，通过实施例1方法制备得到。
[0044] 一、试验材料
[0045] 1、药品与试剂
[0046] 受试药名称：复方银灵通胶囊：性状：棕色粉末（按照实施例方法制备得到）， 人用量：成人服用生药材量：18. 168g，6. Og浸膏粉末/人.d \每克浸膏粉末相当于生药 3. 028g。配制方法：将受试药用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混悬液。
[0047] 银杏叶片：扬子江药业集团有限公司，规格：每片含总黄酮醇苷19. 2mg，萜类内酯 4. 8mg，批号：12053121。药物配制：临用前用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混 悬液。
[0048] 阿司匹林肠溶片：拜耳医药保健有限公司，规格：100mg，临用前用0. 5% CMC-Na研 磨配制成所需浓度的均匀混悬液。
[0049] 水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，临用前用0. 9%氯化钠注射液配制成浓 度为3%的溶液。
[0050] 红四氮唑（TTC)，国药集团化学试剂公司产品，临用前称取TTC粉末，用磷酸盐缓 冲液溶解配制成1 %的TTC溶液。
[0051] 甲醛溶液：A. R，西陇化工股份有限公司产品，规格：500ml/瓶，批号：1005152。
[0052] 血小板活化因子（PAF) :SIGMA公司产品。
[0053] 配制：①取PAFlmg，置于2.6ml氯化钠注射液中使溶解，分装于具塞密封管中 0.1 ml/支，-20°C保存，临用前以氯化钠注射液100倍稀释备用（浓度为7. 072 μ mol/L)。② 取PAF 5mg，用DMSO溶解配制为母液，-20°C保存。临用前用灭菌PBS稀释至所需浓度（作 用于神经元的终浓度为40 μ mol/L) 〇
[0054] 5 '-腺苷二磷酸二钠盐（ADP) :SIGMA 公司，批号：YY1124B056W。
[0055] 配制：①取IOmg ADP，置6. 64ml 0· 9%氯化钠注射液中，震荡至完全溶解，先配成 3mmol/L的保存液，分装于具塞密封管，0.1 ml/支，-20°C保存。临用前以0. 9%氯化钠注射 液稀释10倍即可（浓度为300 μ mol/L)。②取400mg ADP，用生理盐水配成20mg/ml的溶 液。
[0056] MEM培养基：美国GIBCO公司，批号：1133365。取MEM粉末溶于1000 ml灭菌三蒸 中，用NaHC03调pH值至7. 0,过滤除菌、分装，4°C冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清。
[0057] 无糖 EBSS (Earle' s balanced salt solution)缓冲液：称取 NaCl 6. 8g、 NaHC032. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 ·2Η20 0· 265g、MgSO40.0 9767g、NaH2PO4O. 122g，溶于 1000ml 三 蒸水中，pH7. 2-7. 4,过滤除菌，4°C冰箱保存。
[0058] 含糖 EBSS 缓冲液：称取 NaCl 6. 8g、NaHC032. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 · 2H20 0· 265g、 MgSO40.0 9767g、NaH2PO4O. 122g、葡萄糖 lg，溶于 1000ml 三蒸水中，pH7. 2-7. 4,过滤除菌， 4 °C冰箱保存。
[0059] 消化液：胰酶，BI0SHARP公司产品；胰酶用PBS配至0. 25%，过滤除菌；EDTA用PBS 配至0.02%，高压灭菌。胰酶、EDTA 1 :1混合，4°C冰箱保存。
[0060] β -actin，山羊抗兔（抗小鼠）IgG，：北京博奥森生物技术有限公司产品。
[0061] Syn 抗体，NF- κ B p65 抗体，NF- κ B pp65 抗体：Ι κ B α 抗体，ρ? κ B α 抗体均为 Santa Cruz Biotechnology 公司产品。
[0062] 2、试验动物
[0063] 雄性清洁级SD大鼠，体重250~300g，苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供， 生产许可证号：SCXK (苏）2009-0001 ;白色家兔，体重I. 8-2. 0kg，由南京市江宁区青龙山动 物繁殖场提供，动物生产许可证号=SCXK (苏）2012-0008。
[0064] 二、实验方法与结果：
[0065] 1、复方银灵通胶囊治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所致脑损伤的保护作 用（第一天给药3次，以后每天给药一次，连续给药14天）
[0066] I. 1对死亡率、神经行为学评分、脑含水量、梗塞率的影响
[0067] 清洁级雄性SD大鼠105只，体重250_300g，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)模型 [1]。伪手术组大鼠除不插入线栓外，其他操作同模型组。造模后将动物分为7 组，每组15只，复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：I. 2g/kg (0. 24g/ml)，0. 6g/kg (0. 12g/ ml)，0· 3g/kg(0· 06g/ml)。阳性对照药银杏叶提取物组4mg/kg(0· 8mg/ml)。另设伪手术组 及缺血模型对照组（均给以等容积的〇.5%CMC-Na)。于复灌后3h开始灌胃给药，每天给 药一次，总共给药15天，首次给药剂量为维持量的3倍。
[0068] 实验过程中观察并记录动物的死亡情况（死亡前症状和死亡数）。即记录动物的 存活率。
[0069] 渔线的制备：将一长40mm，直径0. 26mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标 记端18_处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。
[0070] 于第一次给药后0. 5h始，隔天参照神经功能缺陷评分法（18分标准）对各组大鼠 进行评分[2]，标准如下：
[0071] 大鼠神经行为学评分标准
[0072]
[0074] 上述指标测定后，将大鼠麻醉，测脑温，之后处死大鼠。取出大脑，迅速置于_20°C 速冻l〇-15min，至鼠脑变硬时，从额极2mm开始，做冠状均切五刀，后方至大脑与后脑交 界处，切成2mm厚的六片后迅速将脑片置于适量1% TTC的磷酸缓冲溶液中[3]，避光温孵 [4]，每隔7~8分钟翻动一次，不时观察脑片颜色变化，待红色区鲜明显现时取出脑片（约 30min)，用数码相机拍照后输入电脑，之后用Image pro plus计算梗塞区（白色）和两半 脑体积，计算梗塞百分比如下：
[0075] 脑梗死体积百分比={[总梗死体积_(右半脑体积-左半脑体积）]/左半脑体 积} XlOO % ο
[0076] 将染色后的脑组织称得大脑湿重，然后置于110°C烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑 含水量如下 [5]:
[0077] 脑组织含水量（％) = (1-脑组织干重/脑组织湿重）X 100%
[0078] 结果见表1~表2。
[0079] 表1对局灶性脑缺血再灌注大鼠死亡率的影响（I土^
[0081 ] 各组死亡率如上表所示。随银灵通剂量升高，大鼠死亡率有逐渐降低的趋势。
[0082] 表2对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分的影响（:?士
[0085] #ρ〈0· 05, ##p〈0. 01 模型对照组 vs.伪手术组；*ρ〈0· 05, **p〈0.0 lvs.模型对照组； ap〈0. 05, aap〈0. 01银灵通组vs.银杏叶片组；bp〈0. 05, bbp〈0. 01银灵通组vs.阿司匹林组
[0086] 由表2可见，伪手术组未见明显的神经行为学损伤。与伪手术组相比，模型组自 缺血后第一天开始，神经行为学评分均极显著性降低（p〈〇. 01)。与模型对照组相比，银灵 通高剂量组能显著性升高缺血再灌注后第8d大鼠神经行为学评分（p〈0. 05)，能极显著性 升高缺血再灌注后第l〇d、12d、14d大鼠神经行为学评分（p〈0.01);银灵通中剂量组能显著 性升高缺血再灌注后12d大鼠神经行为学评分（p〈0. 05)，能极显著性升高缺血再灌注后第 14d大鼠神经行为学评分（p〈0. 01)。银灵通各剂量组与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组 第14d神经行为学评分显著性降低（p〈0. 05)。
[0087] 表3对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑温、梗塞百分比及脑组织含水量的影响(?)
[0089] #ρ〈0· 05, ##p〈0. 01 模型对照组 vs.伪手术组；*ρ〈0· 05, **p〈0