白对照组；ap〈0. 05, aap〈0.0 lvs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0.01vs.阿司匹林组
[0225] 由表18可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组小鼠断尾后出血时间极显著性延长 (P〈〇. 01)，银杏叶片、银灵通高剂量、中剂量组出血时间显著性延长（P〈〇. 05)，其他组别与 阴性对照组相比无显著性差异（P>〇. 05)。
[0226] 与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组出血时间显著性缩短（p〈0. 05);银灵通 其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0227] 5. 2对小鼠凝血时间的影响
[0228] 取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19~22g，随机均分为5组，每组10只： 复方银灵通胶囊 3 个剂量组，分别为：2. 4g/kg (0. 12g/ml)，I. 2g/kg (0. 06g/ml)，0. 6g/ kg(0. 03g/ml)。阳性对照药I银杏叶片片组8mg/kg(0. 4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组 60mg/kg (3mg/ml)。阴性对照组（给以等容积的0· 5 % CMC-Na)。各组每日灌胃给药1次， 连续给药7日，给药容积为0. 4ml/20g。
[0229] 末次给药Ih后，用毛细玻管自眼内眦插入，即有血液流出，并滴于载玻片上。每隔 15s用大头针自血液边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起。从采血开始到挑起血丝止，所 用时间即凝血时间 [17'18]。
[0230] 表19复方银灵通胶囊对小鼠凝血时间的影响n=10:)
[0232] *ρ〈0· 05**ρ〈0· Olvs.空白对照组；ap〈0. 05, aap〈0.0 lvs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0.01vs.阿司匹林组
[0233] 由表19可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组能极显著性延长小鼠凝血时间 (P〈〇. 01)，银灵通高剂量组能显著性延长小鼠凝血时间（P〈〇. 05)，其他各组与阴性对照组 相比均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0234] 银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（p>0. 05)。
[0235] 6、复方银灵通胶囊含药血清预防给药对体外培养皮层神经元的保护作用-机理 研究
[0236] 6. 1大鼠含药血清制备[19'2°]
[0237] SD大鼠24只，250g-300g，按体重随机分为阳性药1银杏叶片组26. 7mg/kg、阳性 药2阿司匹林组200mg/kg、银灵通组4g/kg，空白对照组，每组6只，灌胃给药，给药体积为 lml/100g，空白对照组给予等体积的0. 5% CMC-Na，每天给药两次，连续给药4天。最后一 次给药后lh，无菌颈总动脉取血，取血后室温静置2h，3000rpm离心20min，取上清液，将同 组血清混合，56°C灭活30min，超净台过滤除菌，分装保存于-80°C备用 [21]。
[0238] 6. 2皮层神经元细胞原代培养
[0239] 根据Choi DW的方法略加改进，进行大鼠原代皮层神经元培养。取怀孕15-18天的 SD大鼠1只[22]，水合氯醛麻醉。用75 %乙醇对母鼠腹部消毒，剪开腹腔，将胎鼠取出先放入 75 %乙醇中短暂浸泡消毒，再放入预冷的PBS中。在超净台中剪下胎鼠的头颅（从耳后剪）， 放入预冷的PBS中，将大脑全部取出放入预冷的PBS中。然后，将大脑皮层取下，去除脑膜， 将皮层剪碎后转移至离心管中。加入胰酶于37°C消化10分钟，每5分钟进行吹打混匀。加 入胎牛血清终止消化，然后继续吹打，再加入10% MEM培养基（每500mLMEM中含胎牛血清 50mL)吹打重悬。然后用100目筛网过滤，再用400目筛网过滤，转移滤液到干净离心管中离 心（1000rpm)5分钟。离心后弃去上清液，加入10%培养基吹打重悬。倒置显微镜下计数， 按照细胞密度IX IO6个/mL将细胞接种于预先用细胞粘附剂处理过夜的无菌培养板中，置 于37°C，CO2浓度为5%的无菌培养箱中孵育约4h，于显微镜下观察待细胞充分贴壁后，将 10% MEM培养基换成神经元专用的维持培养基（Neurobasal Media 49mL+B27_Supplement lmL)[23]。待细胞呈现神经元的形态即可用于实验[24' 25]。
[0240] 6. 3实验模型制备方法
[0241] 6. 3. 1连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型（预 防给药）
[0242] 参照文献，稍加改进[26]，在无糖EBSS溶液中加入终浓度为IOmM的连亚二硫酸钠 (Na 2S2O4)干粉充分溶解，用NaHCOdJf pH为7. 2,即为缺氧溶液。此溶液需现用现配，为了消 除~&2&04在水中分解产物的影响，除设空白对照组（对照组1)外，另设一非低氧溶液对照 组（对照组2)，非低氧溶液的配制是预先配制IOOmM的缺氧Na 2S2O4储备液，用时将储备液 (3天以上）稀释至10mM，即为IOmM Na2S2O4常氧溶液。
[0243] 设空白对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）、非低氧溶液对照组（加 入占总体积15%的空白对照组血清）、模型对照组（加入占总体积15%的空白对照组血 清）、阳性对照1银杏叶片组（加入占总体积15%的银杏叶片组含药血清）、阳性对照2阿 司匹林组（加入占总体积15%的阿司匹林组含药血清）和复方银灵通胶囊高（加入占总体 积15%的银灵通含药血清）、中（加入占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血 清）、低（加入占总体积5%的银灵通含药血清+10%空白对照组血清）剂量组，每个剂量设 3个复孔，实验重复3次（MTT设6个复孔，实验重复3次）。取培养于24孔板生长良好的 皮层神经元细胞用于试验，加入各组血清，作用24h，弃去原液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡 洗两遍，换成含有终浓度为IOmM的Na 2S2O4的无糖EBSS溶液培养Ih (空白对照组加入含糖 的EBSS)，同时用医用胶布将板四周封住，孵育Ih后换去缺氧培养液，用含糖的EBSS溶液轻 轻荡洗两次，换成正常含B-27supplement的Neurobasal培养液，置37°C、5 % 0)2培养箱内 继续培养24h，形成缺氧/复氧损伤模型。
[0244] 6. 3. 2血小板活化因子（PAF)致皮层神经元细胞损伤模型（预防给药）[27]
[0245] 将皮层神经元细胞以IXlO6个/mL密度接种于24孔，置37°C，5% CO2培养箱中孵 育。每孔设空白对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）、非低氧溶液对照组（加 入占总体积15%的空白对照组血清）、模型对照组（加入占总体积15%的空白对照组血 清）、阳性对照1银杏叶片组（加入占总体积15%的银杏叶片组含药血清）、阳性对照2阿 司匹林组（加入占总体积15%的阿司匹林组含药血清）和复方银灵通胶囊高（加入占总体 积15%的银灵通含药血清）、中（加入占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血 清）、低（加入占总体积5%的银灵通含药血清+10%空白对照组血清）剂量组，24孔板每 个剂量设3个复孔，实验重复3次。取培养第三天的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养 液，用PBS轻轻荡洗两次，加入各组血清培养24h后，弃去原培养液，用PBS轻轻荡洗两次， 加入新鲜培养液及终浓度为4X 10 5M的PAF，置37°C、5% CO2培养箱内继续培养48h。
[0246] 6. 4指标观察测定
[0247] 细胞形态学观察，MTT法测定细胞活力，LDH释放测定，LD含量测定，SOD活力测定， MDA含量测定均按照常规方法。
[0248] 6. 5实验结果
[0249] 6. 5. 1复方银灵通胶囊含药血清预防给药对连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致 皮层神
[0250] 经元细胞缺氧缺糖损伤模型的影响
[0251] 细胞形态学观察：皮层神经元细胞经Na2S2O4处理约24h后，倒置显微镜下观察： 正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元 细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入银杏叶片、 阿司匹林、复方银灵通含药血清进行预保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多 细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。
[0252] MTT法测定细胞活力
[0253] 表20银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞存活率的影响（Its，n==6)
[0256] ep〈0. 05eep〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Ap〈0. 05AAp〈0. 01模型对照组 与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05**p〈0. 01 与模型对照组比
[0257] 较；ap〈0. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0258] 由表20可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、阿司匹林组、银灵通高、中剂量组 含药血清均能极显著性提高细胞存活率（p〈〇. 01)，银灵通含药血清对Na2S2O4合并缺糖造 成的皮层神经元细胞损伤模型OD 5wnni的保护作用随含药血清浓度的增加而增强。
[0259] 银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（p>0. 05)。
[0260] LDH漏出率测定细胞损伤程度
[0261] 表21银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞LDH漏出率的影响 (x：±s, n=^)
[0262]
[0263] cp〈0. 05ccp〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Ap〈0. 05AAp〈0. 01模型对照组 与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05**p〈0. 01 与模型对照组比
[0264] 较；ap〈0. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0265] 由表21可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组LDH漏出率均极显 著性降低（P〈〇. 01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组LDH漏出率均显著性降低（p〈0. 05);其他 各组间比较无显著性差异（P>〇. 05)。
[0266] LD含量测定
[0267] 表22银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞LD含量的影响 (x+s, π=3)
[0270] ep〈0. 05eep〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Αρ〈0. 05ΑΑρ〈0. 01模型对照组 与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05**p〈0. 01 与模型对照组比较；ap〈〇. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组 比较。
[0271] 由表22可见，与模型对照组相比，银杏叶片组及银灵通高剂量组LD含量极显著性 降低（p〈0. 01)，阿司匹林组及银灵通中剂量组LD含量显著性降低（p〈0. 05);与银杏叶片组 相比，银灵通中、低剂量组LD含量极显著性升高（p〈0. 01)，阿司匹林组LD含量显著性升高 (p〈0.05);与阿司匹林组相比，银灵通高剂量组LD含量极显著性降低（p〈0.01);其他各组 间比较无显著性差异（p>〇. 05)。
[0272] SOD活力测定
[0273] 表23银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞SOD活力的影响（its, n=3)
[0275] ep〈0. 05eep〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Ap〈0. 05AAp〈0. 01模型对照组 与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05**p〈0. 01 与模型对照组比较；ap〈〇. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林 组比较。
[0276] 由表23可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组SOD活力极显著性 升高（p〈0. 01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组SOD活力显著性升高（p〈0. 05);与银杏叶片 组相比，银灵通中、低剂量组SOD活力显著性降低（p〈0. 05);其他各组间比较无显著性差 异（ρ>0· 05)。
[0277] MDA含量测定
[0278] 表24银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞MDA含量的影响η=乃
[0279]
[0280] ep〈0. 05eep〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Ap〈0. 05AAp〈0. 01模型对照组 与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05**p〈0. 01 与模型对照组比较；ap〈〇. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组 比较。
[0281] 由表24可知，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组MDA活力均极显著 性降低（p〈0. 01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组MDA活力均显著性降低（p〈0. 05);与银杏叶 片组相比，银灵通低剂量组MDA活力极显著性升高（p〈0. 01);与阿司匹林组相比，银灵通低 剂量组MDA活力显著性升高（p〈0. 05);其他各组间比较无显著性差异（p>0. 05)。
[0282] 6. 5. 2复方银灵通胶囊含药血清预防给药对血小板活化因子（PAF)致皮层神经元 细胞氧化应激损伤模型的影响
[0283] 细胞形态学观察
[0284] 皮层神经元经PAF处理约48h后，倒置显微镜（10 X 10倍）下观察：正常对照组 细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细胞与正常 细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入银杏叶片、阿司匹林、 复方银灵通含药血清进行预保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突 起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。
[0285] MTT法测定细胞活力
[0286] 表25银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞存活率的影响(is, n=6)
[0289] #p〈0. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05#p〈0. 01与模型对照组 比较；ap〈〇. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0290] 由表25可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高、中剂量组细胞存活率 均极显著性升高（P〈〇. 01)，阿司匹林组细胞存活率显著性升高（P〈〇. 05