);与银杏叶片组 相比，银灵通低剂量组细胞存活率显著性降低（P〈〇. 05);其他各组间比较无显著性差异 (p>0. 05)。
[0291] LDH释放测定
[0292] 表26银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞LDH漏出率的影响(i±s，n=3)
[0294] #p〈0. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05#p〈0. 01与模型对照组 比较；ap〈〇. 05，aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0295] 由表26可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组LDH漏出率极显著性减少 (p〈0. 01)，银杏叶片组、银灵通中剂量组LDH漏出率显著性减少（p〈0. 05);其他各组间比较 无显著性差异（P>〇. 05)。
[0296] LD含量测定
[0297] 表27银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞LD含量的影响(?? h=3)
[0300] #p〈0. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05#p〈0. 01与模型对照组 比较；ap〈〇. 05，aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0301] 由表27可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组细胞LD含量极显 著性降低（P〈〇. 01)，银灵通中剂量在细胞LD含量显著性降低（p〈0. 05);其他各组间比较无 显著性差异（P>〇. 05)。
[0302] SOD活力测定
[0303] 表28银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞SOD活力的影响(?? n=3)
[0305] #p〈0. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05#p〈0. 01与模型对照组 比较；ap〈〇. 05，aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0306] 由表28可见，与模型组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组SOD活力极显著性升 高（p〈0. 01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组SOD活力显著性升高（p〈0. 05);与银杏叶片组相 比，银灵通低剂量组SOD活力极显著性降低（p〈0. 01);与阿司匹林组相比，银灵通低剂量组 SOD活力显著性降低（p〈0. 05);其他各组间比较无显著性差异（p>0. 05)。
[0307] MDA含量测定
[0308] 表29银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞MDA含量的影响(1i±s, n=3)
[0309]
[0311] #p〈0. 05##p〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；*p〈0. 05#p〈0. 01与模型对照组 比较；ap〈〇. 05，aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组比较。
[0312] 由表29可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组MDA活力显著性降 低（p〈0. 05);其他各组间比较无显著性差异（p>0. 05)。
[0313] 7、复方银灵通胶囊含药血清治疗给药对体外培养皮层神经元的保护作用-机理 研究
[0314] 7. 1大鼠含药血清制备
[0315] 同 6.1。
[0316] 7. 2皮层神经元细胞原代培养
[0317] 同 6. 2。
[0318] 7. 3实验模型制备方法
[0319] 7. 3. 1连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型（治 疗给药） [26]
[0320] 参照文献，在无糖EBSS溶液中加入终浓度为IOmM的连亚二硫酸钠（Na2S 2O4)干粉 充分溶解，用NaHCOJl pH为7. 2,即为缺氧溶液。
[0321] 取培养于24孔板生长良好的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养液，用含糖的 EBSS溶液轻轻荡洗两遍，换成含有终浓度为IOmM的Na2S2O4的无糖EBSS溶液（空白对照 组加入含糖的EBSS)，同时用医用胶布将板四周封住，孵育Ih后换去缺氧培养液，用含糖的 EBSS溶液轻轻荡洗两次，换成正常含B-27的Neurobasal培养液，同时加入各组血清，置 37°C、5% CO2培养箱内继续培养24h。空白对照组（Control)加入占总体积10%的空白对 照组血清、模型对照组（Vehicle)加入占总体积15%的空白对照组血清、复方银灵通胶囊 高剂量组（银灵通-H)加入占总体积15%的银灵通含药血清、中剂量组（银灵通-M)加入 占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血清、低剂量组（银灵通-L)加入占总体 积5%的银灵通含药血清+10%空白对照组血清，阳性对照银杏叶片组（银杏叶片）加入占 总体积15%的银杏叶片组含药血清，阿司匹林组（ASP)加入占总体积15%的阿司匹林含药 血清，每个组别设3个复孔，实验重复3次。
[0322] 观察指标测定：
[0323] MTT法测定细胞活力，LDH释放及SOD、MDA活力测定均按照常规方法。
[0324] 7. 3. 2血小板活化因子（PAF)致皮层神经元细胞损伤模型[27]
[0325] 取培养于24孔板生长良好的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养液，用PBS轻 轻荡洗两次，加入新鲜培养液及终浓度为4X 10 5M的PAF，置37°C、5% C02培养箱内继续 培养。3h后加入各组含药血清。设空白对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）、 模型对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）和复方银灵通胶囊高（加入占总体 积15%的银灵通含药血清）、中（加入占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血 清）、低（加入占总体积5%的银灵通含药血清+10%空白对照组血清）剂量组，阳性对照银 杏叶片组（加入占总体积15%的银杏叶片组含药血清），置37°C、5% C02培养箱内继续培 养24h，每个剂量设3个复孔，实验重复3次。
[0326] 指标观察测定：
[0327] MTT法测定细胞活力：LDH释放及SOD、MDA活力测定均按照常规方法。
[0328] 对PAF诱导的体外神经元损伤NF- κ B信号转导通路的研究：
[0329] 采用6孔板进行神经元培养，PAF造模结束加入含药血清24h后，用PBS荡洗细胞 培养板两次，加入适量〇. 125%胰酶边消化边用移液枪吹打至下层细胞漂浮，加入微量胎牛 血清终止消化，同组合并转移至I. 5ml离心管中，2000rpm离心10min，倒掉消化液保留下层 细胞，加适量RIPA裂解液（含PMSF ImM)涡旋混匀，然后于冰浴中裂解30min，每隔5min涡 旋混勾，4°C，12000rpm离心5min，分离出上清，BCA法进行蛋白定量，测定上清液体积，加入 5XSDS上样缓冲液后沸水煮沸5min，分装后于-80°C保存。配制4%浓度聚丙烯酰胺浓缩 胶和10%浓度聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)分离胶进行电泳，按20yg蛋白的溶液体积上样。待 所需目的蛋白处MARK充分分离后停止电泳。参照MARK的分子量指示，切割出含目的蛋白 的PAGE胶，与预先用甲醇活化的PVDF膜一起做成"三明治"形状，其排列依次为：海绵/滤 纸/胶/膜/滤纸/海绵。湿法转膜，在IOOmA恒流下进行电转2小时。转膜结束后，取下 PVDF膜，封闭液封闭Ih以消除非特异背景。TBST洗掉封闭液，一抗4°C孵育过夜。用TBST 室温下荡洗三次，每次lOmin。二抗室温下孵育2h后，TBST荡洗三次，每次lOmin。滴加适 量Ecl显色液，用凝胶成像仪对膜进行曝光拍照，用Quantity one图像处理软件分析目标 条带的净光密度值。实验重复三次。
[0330] 7. 4实验结果
[0331] 7. 4. 1复方银灵通胶囊含药血清治疗给药对连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致 皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型的影响
[0332] 表30银灵通治疗给药对连二亚硫酸钠所致的神经元损伤中细胞存活率的影响 (平均值土s.d.，n = 3)
[0335] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型对照与空白对照组比较；*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01与模型对照 组比较。
[0336] 皮层神经元细胞经Na2S2O4*理后加入含药血清约24h后，倒置显微镜下观察：正 常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细 胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入复方银灵通 含药血清的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少， 而且细胞有光泽。
[0337] 由表30可见，与模型对照组相比，银灵通-H组和银杏叶片组都能对0⑶造成的体 外神经元损伤起到很好的保护作用（P〈〇. 01)，银灵通-M也能显著性提高神经元在OGD后的 存活率（p〈〇. 05)。
[0338] 表31银灵通治疗给药对连二亚硫酸钠所致神经元损伤中LDH漏出率、SOD及MDA 活力的影响（平均值土 s. d.，η = 3)
[0340] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型对照与空白对照组比较；*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01与模型对照 组比较。
[0341] 由表31可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组能极显著性降低0⑶造模后细 胞上清液中LDH漏出率（ρ〈0. 01)，银灵通中剂量组能显著性降低LDH漏出率（ρ〈0. 05)。表 明银灵通能很好地减轻OGD导致的细胞损伤。银灵通高剂量组能极显著性降低OGD导致的 体外神经元MDA活力的增高，降低脂质过氧化损伤。
[0342] 0⑶造模后，SOD活力极显著性降低（ρ〈0. 01)，表明神经元的抗氧化系统遭到严重 破坏，而银灵通高剂量组能显著性地升高神经元O⑶损伤后SOD活力（p〈0. 05)，起到良好的 抗氧化损伤作用。
[0343] 表32银灵通治疗给药对PAF所诱导的体外神经元损伤中细胞存活率的影响（平 均值土 s. d.，η = 3)
[0345] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型对照与空白对照组比较；*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01与模型对照 组比较。
[0346] PAF造模后加入含药血清处理约24h后，倒置显微镜（10 X 10倍）下观察，正常 对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细 胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入复方银灵 通含药血清进保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀 细胞减少，而且细胞有光泽。由MTT结果可见，银灵通高剂量组细胞存活率极显著性升高 (p〈0. 01)，银灵通中剂量组细胞存活率显著性升高（p〈0. 05)。
[0347] 表33银灵通治疗给药对PAF所诱导的体外神经元损伤中LDH漏出率、SOD及MDA 活力的影响（平均值土 s. d.，η = 3)
[0349] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01模型对照与空白对照组比较；*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01与模型对照 组比较。
[0350] 由表33可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组细胞上清中LDH漏出率显著性 下降（p〈0. 05)，银灵通中剂量组LDH漏出率也显著性下降（p〈0. 05)。
[0351] 由表33可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组、中剂量组、银杏叶片组MDA活 力显著性降低（p〈〇. 05)，银灵通高剂量组SOD活力极显著性升高（p〈0. 01)，银灵通中剂量 组神经元SOD活力显著性升高（ρ〈0· 05)。
[0352] 表34银灵通对PAF诱导的体外神经元损伤中NF-κ B信号转导通路的影响（平均 值土 s. d.，η = 3)
[0354] #ρ〈(λ 05, ##ρ〈(λ 01模型对照与空白对照组比较；*ρ〈(λ 05, #ρ〈(λ 01与模型对照 组比较。
[0355] 如表34可见，银灵通高剂量组能极显著性地抑制PAF诱导的ρ65和ρρ65表达的 升高（ρ〈0. 01)，银灵通中剂量组也能起到显著的作用（ρ〈0. 05)。此外，银灵通还能抑制 I κ B α磷酸化蛋白的表达。由此可见，银灵通可通过阻止ρ65和I κ B α的磷酸化来抑制 PAF诱导的NF- κ B信号通路的激活。
[0356] 由表34可见，经PAF损伤后，体外神经元细胞Syn的表达量极显著性降低 (ρ〈0. 01)，表明该条件下，神经元细胞遭受了非常严重的损伤。而银灵通对体外神经元Syn 表达量的影响与体内结果一致，与模型对照组相比，银灵通高剂量组能极显著性增加 Syn 的表达量（Ρ〈〇. 01)，银灵通中剂量组也能极显著性地增加 Syn的表达量（ρ〈0. 01)，对PAF 诱导的体外神经元损伤起到很好的保护作用。
【具体实施方式】 [0357] 实施例1
[0358] 1、配方：
[0359] 灵芝333g银杏叶333g淮牛膝278g
[0360] 玄参278g石菖蒲167g天麻 125g
[0361] 2、制备方法：
[0362] (一）粉碎：将石菖蒲粉碎成颗粒，备用。
[0363] (二）CO2超临界萃取：取石菖蒲颗粒于萃取釜中，CO2超临界萃取，其中压力为 30Mpa，萃取釜温度为60°C，萃取时间为1. 5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物，备用。
[0364] (三）挥发油包合：取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液，备用；另取 挥发油重量4倍量的β -环糊精，用β -环糊精4倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴 加上述挥发油乙醇溶液，碾磨包合20分钟，倾出，0-4 °C冷藏静置24小时以上，滤过，于40 °C 真空干燥，即得挥发油包合物，备用；
[0365] (四）醇提：灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药 材8倍重量浓度为90 %的乙醇，加热回流提取两次，每次1. 5小时，提取液合并，静置，滤过， 滤液减压回收乙醇，浓缩至60°C条件下相对密度为1. 15~1. 30的清膏，测定干膏率，备用。
[0366] (五）混合干燥：将清膏与清膏重30-40%的微晶纤维素混合，置真空干燥箱60°C 条件下减压干燥，得干霄备用。
[0367] (六）粉碎、混合、胶囊填充：将干膏、环糊精包合物置万能粉碎机中粉碎成细粉， 与剩余微晶纤维素和干膏重〇. 5 %的硬脂酸镁混合均匀，得细粉。其中，步骤五和步骤六共 用微晶纤维素总量与清膏的重量比例为237. 5 :260。
[0368] (七）胶囊填充：取0号硬胶囊填充，装量：0· 5g。
[0369] 参考文献
[0370] [1JNAGAKANNAN P, SHIVASHARAN B DjTHIPPESffAMY B S, et