行 孵育。
[0069] (2)免疫组化法评价胶原蛋白的生成
[0070] 孵育后，细胞用PBS洗涤三次。然后，将细胞固定在4%多聚甲醛中，4°C储存过 夜。固定的细胞用稀释在PBS中的0.1%的Triton-XlOO处理5min并用PBS洗5min。处 理后的细胞用3%的H 2O2封闭并用PBS洗5min。用10%正常山羊血清进一步封闭并用PBS 洗5min。兔抗I型胶原蛋白抗体（LSL)在PBS中稀释200倍加入细胞中，然后孵育lh，并 用PBS洗5min。将在PBS中稀释400倍的生物素标记的抗兔IgG抗体（Dako A/S)加入到 细胞中，然后孵育30min，并用PBS洗5min。将在PBS中稀释400倍的链霉亲和素标记的 HRP(Dako A/S)加入到细胞中，然后孵育30min，并-用PBS洗5min。在细胞中加入DAB溶 液（3,3' -二氨基联苯胺盐酸盐（3,3' -diaminobenzidine tetrahydrochloride) (30mg)、 蒸馏水（75mL)、0· 2M PBS(75mL)、30% H2O2(K)O yL)和 8%氯化镍（ImL))并孵育 5min。然 后将细胞用PBS洗5min，并将少量的水溶性封固剂（Aquatex，MERCK)施用在盖玻片上，然 后将其贴至载玻片上。制成的玻片在OLYMPUS IX-70上进行分析，并获得染色细胞的图片。 图2为所得图片。
[0071] 从图2可知，加入芝麻素酚的(XD-10595K细胞比对照染色更强，这表明芝麻素酚 的加入增加了胶原蛋白的量。结果说明，芝麻素酚具有促进成纤维细胞生成胶原蛋白的能 力。
[0072] 实施例3 :芝麻素酚对成纤维细胞胶原蛋白和弹性蛋白生成能力的影响
[0073] (1)细胞培养
[0074] 来自人正常皮肤的成纤维细胞CCD-10595K株（购自DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.)接种在直径35mm的塑料培养皿中，并在保温箱中于37°C和5% CO2条件下培养 至细胞达到汇合。然后，用含有芝麻素酚终浓度15或30 μ g/mL的芝麻素酚溶液的培养基 替换原培养基，并在保温箱中于37°C和5% CO2条件下培养所述细胞24h。选用的培养基同 实施例1的培养基。每2天更换培养基至细胞达到汇合。作为对照，用不含芝麻素酚溶液 的培养基进行孵育。
[0075] (2)用免疫印迹分析法评价胶原蛋白和弹性蛋白的生成
[0076] 孵育后，细胞用PBS洗两次并用细胞刮刀收集在I. 5mL离心管中。将所述离心管 离心（15000rpm，4°C，15s)以除去上清液，回收沉淀物（细胞）。在回收的细胞中加入适量 细胞裂解液（1 % NP-40 和 1 % Triton-XlOO, ImM PMSF，10 μ g/mL 亮抑酶肽（Ieup印tin)和 10以8/1111抑肽酶（3口1'〇1:;[11；[11))并祸旋所述离心管。将离心管在冰上冷却301]1；[11后用超 声处理（处理311^11间隔20 8,4个循环）以破坏细胞。将所述离心管离心（15000印111，4°(：， 20min)，，并收集含可溶性细胞裂解物的上清液。用赛瓦蓝G(Serva Blue G，购自Serva Electrophoresis GmbH)对收集的小份上清液进行蛋白定量，基于595nm处的吸光度来计 算用于电泳的样本量。
[0077] 含细胞裂解上清液和样品缓冲液等体积混合，90°C加热5min制备电泳样品。将所 得样品进行电泳，并根据标准方法转移到PVDF膜上。膜转移后用5%脱脂牛奶封闭，与下述 一抗进行反应，然后用PBS洗5min。然后将和一抗反应后的膜与下述二抗进行反应，并用 PBS洗5min。接下来将膜在DAB溶液（3, 3'-二氨基联苯胺盐酸盐（3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride，IOmg)、蒸馈水（ImL)、0· 2M PBS(50mL)和 30% H2O2(K)O μ L))中进行 反应，干燥，然后用Scion Image(免费软件：Scion)定量条带的强度。计算样品的I型胶 原蛋白或弹性蛋白的条带强度相对于β-肌动蛋白的条带强度的比例。
[0078] 本实施例中使用的一抗和二抗如下：
[0079] (-抗）
[0080] 兔抗 C0L1A 抗体（C-18) (sc-8784-R: Santa Cruz)
[0081] 小鼠抗弹性蛋白抗体（Acris Antibodies GmbH)
[0082] 小鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体（1A4) (Dako A/S)
[0083] (二抗）
[0084] 生物素标记的抗兔IgG抗体（Dako A/S)
[0085] 生物素标记的抗小鼠 IgG抗体（Dako A/S)
[0086] 实验结果如图3和4所示。在图3和4中，显示了加入芝麻素酚的细胞中比例，对 照细胞的比例为1。由图3和4可知，加入芝麻素酚提高了胶原蛋白和弹性蛋白的表达水 平。因此，该结果表明，芝麻素酚具有促进成纤维细胞生成胶原蛋白和弹性蛋白的能力。
[0087] 配方实施例
[0088] 本发明的组合物的配方实施例描述如下。其中使用的芝麻素酚是按以上制备实施 例中描述的方法制备的。在下面的配方实施例中，成分的量由"重量％ "表示。
[0089] (配方实施例1)
[0090] 乳霜
[0091] 乳霜的制备如下。将（A)中所示的成分混合，并将混合物在80°C加热，分别地，将 (B)中所示的成分混合，并将混合物在80°C加热。将（B)的混合物逐步加入（A)的混合物 中，同时搅拌乳化，而后冷却到35°C制成乳霜。
[0097] (配方实施例2)
[0098] 爽肤水
[0099] 爽肤水的制备如下。将（A)中所示的成分混合，并将混合物在80°C加热，混匀后冷 却。在35°C条件下将（B)中所示的成分顺序加入，混匀后制成爽肤水。
[0104] 本申请涉及2013年7月4日提交的日本申请No. 2013-140751，其权利要求书、说 明书、附图和摘要通过引用整体并入本文。
【主权项】
1. 一种用于促进胶原蛋白生成，促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细胞迀移的组 合物，所述组合物含有芝麻素酚作为活性成分。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物为用于化妆品或创伤愈合的外用 组合物。3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物为化妆品、准药品或药品的形 式。4. 根据权利要求3所述的组合物，其中，所述化妆品为爽肤水、乳霜、乳液、洗剂、粉底、 精华液、面膜、美容面膜或清洁产品。5. 芝麻素酚在制备用于促进胶原蛋白生成、促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细 胞迀移的组合物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其中，所述组合物为用于化妆品或创伤愈合的外用组 合物。7. 根据权利要求6所述的应用，其中，所述组合物为化妆品、准药品或药品的形式。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其中，所述化妆品为爽肤水、乳霜、乳液、洗剂、粉 底、精华液、面膜、美容面膜或清洁产品。9. 一种用于促进胶原生成、促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细胞迀移的方法， 该方法包括给药含有芝麻素酚作为活性成分的组合物。10. 根据权利要求9所述方法，其中，所述组合物为用于化妆品或创伤愈合的外用组合 物。11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述组合物为化妆品、准药品或药品的形式。12. 根据权利要求10或11所述方法，其中，所述化妆品为爽肤水、乳霜、乳液、洗剂、粉 底、精华液、面膜、美容面膜或清洁产品。13. 芝麻素酚在促进胶原蛋白生成、促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细胞迀移 中的应用。14. 根据权利要求13所述的应用，其中，所述应用为用于皮肤化妆品或创伤愈合。
【专利摘要】本发明涉及用于促进胶原蛋白生成、促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细胞迁移的组合物，所述组合物含有芝麻素酚作为活性成分。本发明还涉及一种用于促进胶原蛋白生成、促进弹性蛋白生成和/或促进角质形成细胞迁移的方法，该方法包括给药含有芝麻素酚作为活性成分的组合物。
【IPC分类】A61P17/02, A61K8/49, A61P43/00, A61K31/36, A61Q19/08, A61K36/18
【公开号】CN105338978
【申请号】CN201480031870
【发明人】小岛明子, 汤浅勋, 清本邦夫, 大村文乃
【申请人】公立大学法人大阪市立大学, 清本铁工株式会社
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年6月2日
【公告号】US20160175280, WO2015001891A1