换新鲜培养液。待细胞生长至80-90%时，弃去培养液，加入 3血PBS润洗一次，加入1血0. 05 %膜蛋白酶-邸TA溶液消化约2min，加入S倍量培养液 终止消化，将细胞液90化/min离屯、5min，弃去上清液，加入一定量培养液，将细胞吹散，取 10化计数，将歴L化.2细胞接种于96孔板中，每孔2万细胞，并设无细胞空白对照孔。培 养24小时后，弃去原培养基，用憐酸盐缓冲液（PB巧洗一遍，换上无血清无酪红的低糖DMEM 培养液，分组加受试药。
[0030]设空白对照组（加入正常细胞培养液IOOiiL)，模型组（加入含Iymol/L的膜岛 素的细胞培养液100yL)，五味子乙素组（加入含1ymol/L的膜岛素及10ymol/L的五味 子乙素的细胞培养液100^〇，二甲双脈组（加入含1^111〇1/1的膜岛素及1111111〇1/1的二甲 双脈的细胞培养液100yL)，W及五味子乙素与二甲双脈的组合物组（加入含1ymol/L的 膜岛素及含有lOymol/L五味子乙素+Immol/L二甲双脈的细胞培养液lOOyL)。作用24 小时后，用葡萄糖氧化酶法测定每孔培养液的葡萄糖含量，即每孔取去5yL培养液于另一 96孔板中，加入200yL葡萄糖氧化酶测试液，37°C解育30min，于492nm波长下测定每孔吸 光度。在葡萄糖O-lOmmol/L浓度范围内按标准曲线法计算每孔葡萄糖含量。每孔葡萄糖 消耗量=无细胞空白孔培养液葡萄糖含量-每孔培养液葡萄糖含量，每组设3个或3个W 上复孔，相同实验重复3次。
[0031] 葡萄糖含量测定后，原培养孔弃去原培养液，每孔加入含有0. 5mg/mLMlT溶液的 培养液，于37°C、5%C〇2的条件下解育地。弃去上清液，每孔加入100y1DMS0, 37°C，振荡 lOmin，于550nm波长下测定每孔的吸光度值，用于反映细胞的增殖状况，W矫正细胞数目 差异引起的葡萄糖吸收差异。最后计算各组葡萄糖消耗量相对于模型组消耗量的百分比。
[0032] 结果见图2,10Jimol/L五味子乙素，Immol/L二甲双脈和Immol/L二甲双脈与 10ymol/L五味子乙素组合物组作用于膜岛素抵抗的歴L化.2细胞24小时后均可增加葡 萄糖消耗量，经t检验，与模型组比较具有统计学差异。二甲双脈与五味子乙素组合物组的 增加细胞葡萄糖消耗量效果显著优于五味子乙素和二甲双脈组。 阳〇3引 实施例3
[0034] 小鼠胚胎肝细胞歴L化.2用含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基于37°C、5% C〇2细胞培养箱中解育，隔天更换新鲜培养液。待细胞生长至80-90%时，弃去培养液，加入 3血PBS润洗一次，加入1血0. 05 %膜蛋白酶-邸TA溶液消化约2min，加入S倍量培养液 终止消化，将细胞液90化/min离屯、5min，弃去上清液，加入一定量培养液，将细胞吹散，取 10化计数，将歴L化.2细胞接种于96孔板中，每孔2万细胞，并设无细胞空白对照孔。培 养24小时后，弃去原培养基，用憐酸盐缓冲液（PB巧洗一遍，换上无血清无酪红的低糖DMEM 培养液，分组加受试药。
[0035] 设空白对照组（加入正常细胞培养液100yL)，模型组（加入含1ymol/L的膜岛 素的细胞培养液100yU，五味子乙素组（加入含1Jimol/L的膜岛素及10Jimol/L的五味 子乙素的细胞培养液100yL)，二甲双脈组（加入含1ymol/L的膜岛素及0. 5mmol/L的二 甲双脈的细胞培养液100yL)，W及五味子乙素与二甲双脈的组合物组（加入含1ymol/L 的膜岛素及含有IOymol/L五味子乙素+0.5mmol/L二甲双脈的细胞培养液IOOiiL)。作 用24小时后，用葡萄糖氧化酶法测定每孔培养液的葡萄糖含量，即每孔取5yL培养液，加 入200yL葡萄糖氧化酶测试液，37°C解育30min，于492nm波长下测定每孔吸光度。在葡萄 糖O-lOmmol/L浓度范围内按标准曲线法计算每孔葡萄糖含量。每孔葡萄糖消耗量=无细 胞空白孔培养液葡萄糖含量-每孔培养液葡萄糖含量，每组设3个或3个W上复孔，相同实 验重复3次。
[0036] 葡萄糖含量测定后，原培养孔弃去原培养液，每孔加入含有0. 5mg/mLMlT溶液的 培养液，于37°C、5%C〇2的条件下解育地。弃去上清液，每孔加入100y1DMS0, 37°C，振荡 lOmin，于550nm波长下测定每孔的吸光度值，用于反映细胞的增殖状况，W矫正细胞数目 差异引起的葡萄糖吸收差异。最后计算各组葡萄糖消耗量相对于模型组消耗量的百分比。
[0037] 结果见图3，10]1111〇1/1^五味子乙素组，0.5111111〇1/1^二甲双脈组和0.5111111〇1/1^二甲双 脈与10ymol/L五味子乙素组合物组作用于膜岛素抵抗的歴L化.2细胞24小时后均可增 加葡萄糖消耗量，经t检验，与模型组比较具有统计学差异。二甲双脈与五味子乙素组合物 组的增加细胞葡萄糖消耗量效果显著优于五味子乙素和二甲双脈组。 阳0測 实施例4 齡例片剂制备
[0040] 五味子玄素 80g 盐酸二巧双脈 250g 2%蒼丙甲基纤维素溶液 适量 徴轟纤维素 260g 低取化甲基纤维素 6g 硬脂酸漢 4g
[0041] 制备工艺：将处方中微晶纤维素和低取代甲基纤维素过80目筛，称量处方量的五 味子乙素、盐酸二甲双脈与微晶纤维素和低取代甲基纤维素混合均匀，加入2%径丙甲基纤 维素溶液适量制粒，干燥，整粒，加入处方量的硬脂酸儀混匀，压片，即得1000片。 柳42] 实施例5 阳0创片剂制备
[0044] 五味子乙素 J60g 盐酸二甲巧鹏 SOOg 2%径丙甲基纤维素溶液 适量 微晶纤维素 230g 低取代甲基纤维素 6g 硬脂酸镇 4g:
[0045] 制备工艺：将处方中微晶纤维素和低取代甲基纤维素过80目筛，称量处方量的五 味子乙素、盐酸二甲双脈与微晶纤维素和低取代甲基纤维素混合均匀，加入2%径丙甲基纤 维素溶液适量制粒，干燥，整粒，加入处方量的硬脂酸儀混匀，压片，即得1000片。
[0046] 实施例6
[0047] 胶囊剂制备
[0048] 五味子之素 潮g 盐酸二甲双狐 250g 微晶纤维素 数雜 交联接甲基纤维素钢 1鶴 微粉硅胶 60g 硬脂酸議； 4g 5%聚玄贿化咯烧丽水溶液 适量
[0049] 制备工艺：将处方中微晶纤维素和辅料分别过80目筛，称量处方量的五味子乙 素、盐酸二甲双脈与各辅料混合均匀后，加入5%聚乙締化咯烧酬水溶液制软材，制粒，干 燥，整粒、加入滑石粉，混匀，填装胶囊即得1000粒。
[0050] 实施例7 阳0川胶囊剂制备
[0052] 五味子含素 1魚)g 盐酸二甲双脈 沸Og 微晶纤维素 260g 交联猿甲基纤维素纳 16g 微粉硅胶 60g 硬脂酸模 4爸 5%聚乙赌册咯烧醜水溶液 适量
[0053] 制备工艺：将处方中微晶纤维素和辅料分别过80目筛，称量处方量的五味子乙 素、盐酸二甲双脈与各辅料混合均匀后，加入5%聚乙締化咯烧酬水溶液制软材，制粒，干 燥，整粒、加入滑石粉，混匀，填装胶囊即得1000粒。
【主权项】
1. 一种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，包含作为有效成分的二甲双胍或其可 药用盐和五味子乙素。2. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的二甲双胍可药用盐为盐酸二 甲双胍和硫酸二甲双胍中的一种。3. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述二甲双胍或其可药用盐以二甲 双胍计与五味子乙素的浓度比为25:1~100:1。4. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述二甲双胍或其可药用盐以二甲 双胍计的浓度为0. 5mM~ImM。5. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述五味子乙素的浓度为10μΜ~ 20μΜ〇6. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，包括可药用辅料。7. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服给药的剂型。8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述口服给药的剂型为溶液剂、片 剂、胶囊剂或颗粒剂。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗糖尿病的药物组合物，包含作为有效成分的二甲双胍或其可药用盐和五味子乙素。利用该药物组合物可显著改善胰岛素抵抗，增加胰岛素抵抗肝细胞的葡萄糖吸收，其效果显著优于任意单一组分。
【IPC分类】A61K31/155, A61P3/10, A61K31/36
【公开号】CN105343055
【申请号】CN201510662316
【发明人】程翼宇, 范骁辉, 王毅
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年9月30日