一种从不结球白菜提取天然活性物质的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从植物材料提取天然活性物质的方法及其应用，尤其涉及一种从 不结球白菜提取天然活性物质的方法及该提取物的多种应用。
【背景技术】
[0002] 不结球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)是长江中下游地区 主栽蔬菜品种之一，中医认为不结球白菜微寒味甘，有养胃生津、除烦解渴、利尿通便、清 热解毒之功效。民间素有用带根不结球白菜120克，佐以生姜、葱白各10克，煨汤服之，防治 感冒与咳嗽。近20多年来，国内外学者从不结球白菜中分离得到一系列复杂的化学成分， 其中相当一部分具有生理活性。在不久前，日本科学家发现，不结球白菜提取物抗氧化"锈 蚀"的效果非常好，尤以未完全成熟，叶形舒展的嫩株抗氧化效果尤佳。美国国立癌症研究 所发表的防癌食品排行榜中，将不结球白菜排在大蒜的后面，名列第二。最新研究还发现， 不结球白菜提取物能提升血中"好"雌激素代谢物一2羟雌酮的水平，对预防乳腺癌有益。 这说明不结球白菜不但可作为一种较好的绿色食品，同时又具有较好的医学保健作用、药 用价值和经济价值。
[0003] 用DPPH·自由基分析法，即通过检测样品对自由基DPPH·的清除能力来评价该物 质的抗氧化能力的方法去检测不结球白菜提取物的抗氧化性。其抗氧化能力用抑制率表 示，抑制率越大，抗氧化能力越强。类似的方法还有· 0H、02- ·、ABTS+ ·抗氧化活性分析 法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从不结球白菜提取天然活性物质的方法及其应用，该 天然活性物质天然无毒安全，具有较强的生物活性功能，应用后可显著提高细胞免疫水平， 增强机体免疫功能。
[0005] 本发明一种从不结球白菜提取天然活性物质的方法，具体提取方法如下： (1) 冻干粉碎：将不结球白菜净化后用聚乙烯膜真空包装，迅速用液氮冷冻，真空冷冻 干燥后粉碎； (2) 提取：以乙醇水溶液为溶剂，将冻干粉碎的不结球白菜用50-95v/v%乙醇水溶液 提取30-120分钟，得提取液，提取液蒸发浓缩得到粗提物； (3) 萃取：将粗提物用蒸馏水溶解得到水悬液，将其用极性溶剂萃取得萃取液，该极性 溶剂包含但不限于石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇； (4) 浓缩：萃取液经蒸发浓缩得到浓缩提取物； (5) 低压冷冻干燥：浓缩提取物在< 0.OIMPa真空度下进行脱水干燥，即得粉状天然活 性物质。
[0006] 所述的步骤（1)中粉碎细度为50-250目。
[0007] 所述的步骤（2)可以用下列方式进行提取：在超声功率为100~500W，时间为 40~90min，料液比1:2-20、乙醇浓度65-75%条件下提取，抽滤，滤渣重复以上操作一次，合 并两次滤液，旋转蒸发浓缩至近干，得到不结球白菜粗提物。
[0008] 所述的步骤（3)将不结球白菜粗提物用蒸馏水超声溶解15-60min，得到水悬液， 将其用〇. 5-2倍乙酸乙酯萃取2-5次，合并萃取液。
[0009] 所述的步骤（4)使用旋转蒸发方式浓缩。
[0010] 所述的活性物质以100~700mg/kg的量添加在肉鸡的基础日粮中，用于提高饲养 动物产肉性能、免疫功能、抗氧化水平以及改善肉鸡细胞因子mRNA表达水平的用途。
[0011] 本发明从植物中提取有效成分，明确有效成分作用机理，经过试验验证，稳定性良 好、无毒副作用、功能明显，具有安全性、可靠性、有效性、质量可控性，作为一种新型植物化 学功效原料，可作为保健食原料，也可以作为药物进行深度开发，具有良好的市场发展前景 和技术扩展空间。
[0012] 本发明有益效果还包括：1、不结球白菜作为天然活性物质的提取原料来源具有产 量高，生长周期短，便宜易得的优点；2、能有效提取不结球白菜中的活性物质，提取物有较 强的抗氧化生物活性功能，应用效果好，可显著提高细胞免疫水平，增强机体免疫功能；3、 拓展了不结球白菜资源在食品及医学等领域的应用，有利于不结球白菜进一步开发和相关 种植业的发展。
[0013]
【附图说明】
[0014] 图1A为不同料液比对Trolox浓度的影响； 图1B为不同超声时间对Trolox浓度的影响； 图1C为不同乙醇浓度对Trolox浓度的影响； 图1D为不同超声功率对Trolox浓度的影响； 图2为总RNA的琼脂糖电泳图； 图3A为目标基因IL-2㈧与内参基因GAPDH的扩增效率关系图； 图3B为目标基因IL-4(B)与内参基因GAPDH的扩增效率关系图； 图3C目标基因IFN-γ(C)与内参基因GAPDH的扩增效率关系图； 图4ANCCE对鸡脾脏IL-2 (A)mRNA相对表达量的影响关系图； 图4BNCCE对鸡脾脏IL-4 (B)mRNA相对表达量的影响关系图； 图4CNCCE对鸡脾脏IFN-γ(C)mRNA相对表达量的影响关系图； 图5不结球白菜不同极性部位清除DPPH·的能力示意图； 图6不结球白菜不同极性部位清除· 0H的能力示意图； 图7不结球白菜不同极性部位清除02- ·的能力示意图； 图8不结球白菜不同极性部位清除ABTS+·的能力示意图。
[0015] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步详述。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1: 不结球白菜用聚乙烯膜真空包装，迅速用液氮冷冻，真空冷冻干燥后粉碎过100目筛， 在超声功率317W、超声时间60min、温度25-30°C，料液比1:20 (m:V)、乙醇浓度70%的条 件下提取，抽滤，滤渣重复以上操作一次，合并两次滤液。旋转蒸发浓缩至近干，即为不结球 白菜粗提物。将粗提物用蒸馏水超声溶解35min，得到水悬液，将其用等体积乙酸乙酯萃取 4次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩后真空冷冻干燥至恒重，即为不结球白菜提取物（NCCE)， 主要组份为黄酮和多酚类等生物活性物质，将其置于4°C冰箱冷藏保存备用。
[0017] 实施例2: 按照上述从不结球白菜提取天然活性物质的方法，不结球白菜用聚乙烯膜真空包装， 迅速用液氮冷冻，真空冷冻干燥后粉碎过100目筛，在超声功率317W、超声时间60min、料 液比1:20 (m:V)、乙醇浓度70%的条件下提取，抽滤，滤渣重复以上操作一次，合并两次滤 液。旋转蒸发浓缩至近干，即为不结球白菜粗提物。将粗提物用蒸馏水超声溶解35min，得 到水悬液，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，合并各自的萃 取液并保留最后的水相，依次得到石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的萃取 物。各部经旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥至恒重，置于4°C冰箱冷藏保存备用。
[0018] 以上5部分萃取物分别采用清除DPPH·、· 0H、02- ·、ABTS+ ·自由基能力测定， 不同萃取剂提取物的活性测试结果见图5至图8。
[0019] 由图5至图8可知，乙酸乙酯萃取物清除自由基的能力最强。
[0020] 实施例3: 1日龄健康AA肉仔鸡，采用地面平养，自由采食、饮水，给24h光照，饲喂玉米-豆柏 型基础日粮，配制参照NRC1994《家禽的营养需要量》，基础日粮组成及营养水平见表1在 基础日粮中添加根据实施例所得500mg/kg的不结球白菜提取物（NCCE)。
[0021] 不结球白菜提取物（NCCE)，主要组份为黄酮和多酚类等生物活性物质，添加植物 黄酮类物质，可显著提高肉雏鸡免疫器官指数，植物多酚可增加正常小鼠和免疫抑制小鼠 的脾脏和胸腺重量。可见不结球白菜活性提取物可以促进免疫器官的发育，抑制其细胞凋 亡，提高机体抵抗力。
[0022] 发明人采用响应而分析法（ResponseSurfaceMethod,RSM)法优化了不结球白 菜活性物质的提取工艺，以确定各因素及其交互作用对各指标的影响。
[0023] 材料选择：试验材料不结球白菜品种"苏州青"由龙岩学院生物技术课题组提供。 采收后，用聚乙烯膜真空包装，迅速用液氮冷冻，真空冷冻干燥后粉碎过100目筛。
[0024] 方法：DPPH自由基清除试验 称取12. 012mg的Trolox标准品，用蒸馏水定容至200mL。利用超声波将使Trolox标准品得到充分溶解，得到浓度为240μmol/L的Trolox标准品溶液，加入蒸馏水稀释后 分别得到浓度为40,80,120,160, 200μmol/L的Trolox标准品溶液。将质量为10mg的 DPPH用入甲醇定容至100mL，将其稀释后得到浓度为20mg/L的DPPH甲醇溶液。吸取 10μL的Trolox水溶液，加入990μL的DPPH甲醇溶液，用甲醇定容至4mL，混合均匀，暗 处避光反应30min，在517nm处测吸光光度值（ABS)。根据试验结果，使用EXCEL软件的 线性拟合功能绘制DPPH自由基清除法Trolox标准曲线，并得出线性回归方程。
[0025] 步骤一、提取不结球白菜抗氧化活性物质的单因素试验 最佳提取料液比研究 准确称取5.0g不结球白菜粉，在乙醇浓度70%，功率400w，提取时间40min的条件 下，分别考察1:10、1:15、1:20、1:25、1:30及1:35(m:V)的料液比对不结球白菜抗氧化活 性物质提取的影响。
[0026] 最佳超声波处理时间研究 准确称取5.0g不结球白菜粉，乙醇浓度70%，功率400w，料液比1: 20,考察30min、 40min、50min、60min、70min及80min的不同超声时间对不结球白菜抗氧化活性物质 提取的影响。
[0027] 1. 2. 2. 3最佳提取乙醇浓度研究 准确称取5.0g不结球白菜粉，功率400w，料液比1:20,超声时间60min，考察40%、 50%、60%、70%、80%及90%的乙醇浓