治疗肝癌的材料和方法
【专利说明】治疗肝癌的材料和方法
[0001]发明背景
肝癌是世界上第三大癌症杀手，导致全球每年超过50万个体死亡。在中国，肝癌是第二大癌症死因。手术切除(以部分肝切除术或肝移植的形式)是治愈疗法的主体。尽管如此，治愈手术后的癌症复发仍是常见的。此外，肝癌常常在晚期才被确诊，这使得治愈性治疗难以实现。对于大多数肝癌患者的治疗，不存在有效的治疗选项。
[0002]颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)是一种调节胎儿发育、组织修复和各种癌症的肿瘤发生的多能性生长因子。GEP在超过70%的人肝细胞癌(HCC)中过度表达。已显示GEP表达与侵袭性HCC特征相关。功能性研究证实，GEP在调节HCC细胞增殖、浸润、致瘤性和药物抗性方面起作用。而且，GEP的中和可抑制在小鼠模型中确立的HCC的生长。
[0003]癌干细胞(CSC)被认为是癌症的〃根〃。CSC不仅负责肿瘤的发生和进展，而且还赋予干细胞特性，包括自我更新、分化能力和药物抗性。尽管现有的疗法能初步消除肿瘤体积，CSC的干细胞特性使得它们能够存活和繁衍肿瘤，导致疾病复发。因此，CSC根除可能是治愈侵袭性恶性肿瘤(包括HCC)的关键。
[0004]免疫系统具有在肿瘤细胞发展成恶性肿瘤之前识别和消除它们的能力。NK细胞是先天免疫系统的主要组分，并代表对抗肿瘤的第一线防御。NK细胞的抗肿瘤细胞毒性由直接的溶胞作用或IFN-γ的诱导来介导。然而，有报道NK细胞的细胞毒性在HCC患者中受损且NK细胞的活性减少与HCC进展有关。
[0005]NK细胞毒性通过来自它们的与靶细胞上表达的配体相互作用的细胞表面受体的整合信号传导来调节。NKG2D (天然杀伤2族，成员D)是一种在所有NK细胞表面上表达的刺激性受体，并且它的识别对于肿瘤免疫监测是重要的。MHC I类链相关分子A (MICA)是人NKG2D受体的配体，经常在肿瘤中表达，但不在正常组织中表达。MICA和NKG2D的结合强烈地激活NK细胞，增强它们的细胞毒性和细胞因子产生。因此，NKG2D-MICA途径是宿主免疫系统借以识别和消除肿瘤细胞的重要机制。CD94/NKG2A是抑制性受体，其在与靶细胞上的非典型I类人白细胞抗原E (HLA-E)相互作用后控制人NK细胞的活性。HLA-E由体内几乎所有的细胞广泛表达，但由肿瘤细胞过度表达，并且可能通过经由与CD94/NKG2A受体的相互作用的抑制作用，保护肿瘤细胞免遭NK细胞毒活性。
[0006]免疫逃逸是CSC的重要性质之一，这使得它们在宿主中更好地存活。最近发现，ABCB5+恶性黑色素瘤起始细胞具有通过优先地抑制IL-2-依赖性T-细胞激活来调节抗肿瘤免疫力和支持调节T细胞的诱导的能力。而且发现，⑶200+ CSC细胞通过在卵巢癌、黑色素瘤和白血病中下调Thl细胞因子和共刺激分子的表达来抑制抗肿瘤免疫力。然而，在宿主免疫反应的过程中，CSC的评价在HCC中在很大程度上被忽视了。抑制肿瘤细胞从免疫监测中逃逸的治疗方案可用来治疗肝CSC。
[0007]发明简述
本发明提供一种在肝细胞癌(HCC)中抑制免疫逃逸和根除表达GEP的CSC的方法。本发明基于下述出乎意料的发现:颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)表达与人肝癌的免疫逃逸能力相关；GEP与人肝癌中的天然杀伤(NK)细胞活性相关；和抗-GEP抗体治疗增强NK细胞对抗肝癌细胞的细胞毒活性。
[0008]本发明提供一种治疗肝癌的方法，其中所述方法包括给予需要这样的治疗的受试者抑制颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的表达或活性的药剂，和任选的NK细胞和/或促进天然杀伤(NK)细胞活性的药剂。
[0009]在一个实施方案中，促进NK细胞活性的药剂增强NK细胞的细胞毒性。
[0010]在一个特定的实施方案中，本发明提供一种治疗肝癌的方法，其中所述方法包括给予需要这样的治疗的受试者结合颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的抗体，和任选的NK细胞和/或促进天然杀伤(NK)细胞活性的药剂。
[0011]在一个实施方案中，受试者曾经受部分或全部肝切除术和/或肝移植，和本发明可用来预防或减少肝肿瘤或癌复发的可能性。
[0012]本发明还提供一种治疗受试者的肝癌的方法，该方法包括给予受试者有效量的增加存在于肝癌细胞上的MICA活性或表达的药剂。
[0013]本发明还提供一种可溶性MICA水平与无肝癌受试者相比增加的受试者的肝癌的方法，该方法包括给予受试者有效量的抑制颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的表达或活性的药剂。
[0014]本发明还提供一种测定患有肝癌的受试者对用抑制颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的表达或活性的药剂治疗的适宜性的方法，该方法包括i)获得来自受试者的样品和ii)测量样品中可溶性MICA的量。优选地，样品是血液样品，优选为血清样品。该方法可进一步包括将样品中的可溶性MICA的量与可溶性MICA的量和肝癌的存在或进展相关的图表比较，其中与肝癌的存在或进展相关的可溶性MICA的量指示受试者对用抑制颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的表达或活性的药剂治疗的适宜性。
[0015]本发明还提供一种增加MICA在癌细胞上表达的方法，其包括给予有效量的抑制颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的表达或活性的药剂。
[0016]本发明还提供一种评价或监测受试者中肝癌的程度或进展的方法，该方法包括分析来自受试者的样品的可溶性GEP的量。
[0017]附图简述
图1显示HCC细胞的GEP表达调节免疫细胞的抗肿瘤细胞毒活性。(A)在Η印3B (高内源性GEP细胞系)和HepG2 (低内源性GEP细胞系)中的GEP调节。Hep3B细胞被稳定转染用于经shRNA的GEP抑制，而Η印G2细胞被稳定转染用于经全长GEP cDNA的过度表达。在对照和转染子中的GEP的蛋白表达经流式细胞术测量。灰色线:同种型对照染色。(B)GEP抑制增加，而过度表达降低人PBMC对抗HCC细胞的细胞毒性。将用绿色荧光CFSE标记的HCC细胞(靶细胞)与人PBMC (效应细胞)以25:1的效应子/靶比例(E/T比例)共培养5 ho收获细胞和用碘化丙锭(PI)染色，溶解的HCC细胞识别为CFSE+PI+和经流式细胞仪定量。细胞毒性水平如下计算:[细胞毒性(% ) = (CFSE+PI+细胞的％ / (CFSE+PI+细胞的°/c^PCFSE+P厂细胞的％) X 100)。当与对照细胞比较时，*P < 0.05。(C) NK细胞的耗尽显著地消除GEP-介导的细胞毒性。通过磁分选从人PBMC耗尽⑶56+ NK细胞。然后，将NK细胞-耗尽的PBMC与HCC细胞以25:1的E/T比例一起培养5小时。然后经流式细胞术测量细胞毒性。(D) GEP抑制增加，而过度表达降低NK细胞对抗HCC细胞的细胞毒性。采用磁分选从人PBMC中分离CD56+ NK细胞，然后以所示的E/T比例与HCC细胞一起培养5小时。当按各自的E/T比例与对照细胞比较时，* P < 0.05，** P < 0.01。
[0018]图2显示GEP差异调节HCC细胞的MICA和HLA-E的表达。(A) GEP抑制上调膜结合的MICA，和抑制可溶性MICA释放和膜结合的HLA-E表达。Hep3B细胞(高内源性GEP细胞系)被稳定转染用于经shRNA的GEP抑制。膜结合的MICA和HLA-E表达通过表面免疫荧光染色和流式细胞术测定。灰色线:同种型对照染色。在培养物上清液中的可溶性MICA经ELISA测量。(B) GEP过度表达下调膜结合的MICA，并增加可溶性MICA产生和膜结合的HLA-E表达。！fepG2细胞(低内源性GEP细胞系)被稳定转染用于经全长GEP cDNA的过度表达。灰色线:同种型对照染色。
[0019]图3显示通过抗-GEP抗体A23阻断GEP调节HCC细胞的MICA和HLA-E的表达。用抗-GEP单克隆抗体(A23)、小鼠IgG同种型抗体(IgG) (50 J.Lg/ml的抗体)或无抗体(对照)处理Η印3B细胞24h。(A) A23显著地减少Η印3B细胞的GEP表达。(B) A23诱导表面MICA表达，并抑制在Η印3B细胞中的可溶性MICA释放和表面HLA-E表达。虚线:同种型对照染色。当与对照比较时，*P < 0.05，* *P < 0.01。
[0020]图4显示通过抗-GEP抗体A23阻断GEP增强NK细胞经由MICA对抗HCC细胞的细胞毒性。(A)通过抗-GEP抗体A23阻断GEP增强PBMC-介导的对抗HCC细胞的细胞毒性。细胞毒性由抗-MICA中和抗体抑制。用抗-GEP单克隆抗体(A23)、小鼠IgG同种型对照(migG) (50 J.Lg/ml)或无抗体(对照)处理!fep3B和!fepG2细胞24h，然后与PBMC以25:1的E/T比例共培养5h。对于A23治疗，将细胞与PBMC (存在或不存在中和MICA抗体或小鼠IgG2a同种型对照(2 yg/ml))共培养5h。当与对照比较时，* P〈 0.05;各组间的#P < 0.05用水平线表示。(B) A23-增强的NK细胞对抗Hep3B和HepG2细胞的细胞毒性由抗-MICA中和抗体抑制。当与对照比较时，* P〈 0.05，* *P〈0.0 1，* * P〈 0.001 ；当以各自的E/T比例与A23单独治疗比较时，#P < 0.05，## P < 0.001。
[0021]图5显示GEP与(A) MICA和(B) HLA-E在HCC临床样本中的共表达。肝组织被消化成解聚的细胞悬液，并对GEP和MICA或HLA-E的表达进行评价。用三色流式细胞术进行共表达，门控HCC样本的白蛋白+肝细胞。GEP的蛋白表达通过细胞内染色测量，而膜结合的MICA和HLA-E的蛋白表达通过表面染色评价。共表达各自的标记物的细胞在点图的右上象限显示。示出来自3个HCC临床样本的细胞土 SD的平均百分比。表概述了来自3个样品的阳性细胞土 SD的平均百分比。
[0022]图6显示由抗-GEP单克隆抗体A23介导的抗体依赖性细胞毒性。A23剂量依赖性地介导对抗HCC细胞的ADCC。将CFSE标记的Hep3B或Η印G2细胞与或不与所示抗体浓度的抗-GEP抗体Α23 (Α23)或小鼠同种型对照(migG)温育30分钟，然后与或不与PBMC以25:1的E/T比例共培养5h。当与无抗体的对照细胞比较时，* P〈 0.05，* * P〈 0.01。(B)来自人PBMC的CD56+ NK细胞的耗尽显著地消除A23-介导的ADCC。将用CFSE标记的Hep3B或Η印G2细胞与或不与所示浓度的抗-GEP抗体Α23 —起温育30分钟，然后与PBMC或ΝΚ细胞-耗尽的PBMC以25:1的Ε/Τ比例共培养5h。当与无抗体的对照细胞比较时，*Ρ〈0.05，** Ρ < 0.01。(C) Α23-介导的对抗HCC细胞的ADCC依赖于NK细胞。分离CD56+NK细胞并与HCC细胞以所示的E/T比例一起培养5 ho当与无抗体的对照细胞比较时，*P< 0.05，木 < 0.01，** *Ρ〈0.001。
[0023]图7显示从对抗肝癌细胞的肝癌患者分离的天然杀伤(ΝΚ)细胞的效果。A.ΝΚ细胞显示在具有GEP抑制的肝癌细胞(用GEP shRNA转染的hep3B细胞，3B_shl)中的增强的细胞毒性。B.NK细胞显示在具有GEP过度表达的肝癌细胞(用GEP全长转染的Η印G2，G2-FL)中的降低的细胞毒性。
[0024]序列简述
SEQ ID NO: 1是颗粒体蛋白-上皮肽前体(GEP)的cDNA序列。
[0025]SEQ ID N0:2是颗粒体蛋白-上皮肽前体的氨基酸序列。
[0026]SEQ I