· min，萃取时间700min， 得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片 重0.35g。
[0024] 经检测，成品中槲皮素和山柰素的含量为SOSlIg /片。
[0025] 实施例4:山蜡梅叶片抑制黑色素瘤细胞B16细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1.1实验用细胞株 小鼠黑色素瘤细胞B16细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0026] 1.2实验药物 研究药物:本发明山蜡梅叶片:按实施例1方法制备。
[0027] 药液储液：称取IOOmg山錯梅叶片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μηι滤器过滤，500μ Idof f管分装，-20°C存储，同时0.2μπι滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0028] 1.3实验试剂 DMEM( GIBCO公司Cat · No · 12100-061 Lot · No · 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHCO3 (上海久亿化学试剂有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0公司）；EDTA(AMRESC0公司）！Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) ; Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜博亚杜兰经贸有限 公司）；MTT (Biosharp批号：0793) :PBS(实验室自配）； 1.4实验器材 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型 号：SPECTRAMAX 190) ; CO2培养箱(FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制造型号： SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国SprIng公司型号：S/N 020579);精密移液器(法国吉尔森公司型 号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅（日本SANYO公 司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱 (西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂 型号:KA-1000) ;0 · 2μπι滤器(MILLIP0RE型号：SLGP033RB) ; Icm培养皿(NEST公司）、96孔培养 板(NEST公司）;细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.实验方法 I )B16细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C〇2进行常规培养（IOcm培养皿），当细胞生长至对 数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37°C消 化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000 rpm离 心5min，调整细胞悬液浓度3 X IO4个/ml。
[0030] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μ1，培养板放入细胞培养箱中 (37°C，5%C0 2)常规培养。
[0031] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入山蜡梅叶片溶液，继续培养24h。
[0032] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即0·5%ΜΤΤ)，继续培养 4h。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μ1二甲基亚砜，置摇床 上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0034] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液），对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
[0035] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(％ )=(对照孔OD值-给药孔OD 值）、对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0036] 3.统计处理 采用Microsoft Excel 2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean土S.D. 表不。
[0037] 4.实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对B16细胞增殖抑制 有差异(P〈〇. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时 有极显著性差异(P〈〇. 001)。
[0038] 表1山蜡梅叶片对B16细胞增殖抑制影响研究（X土SD)
注：与对照组比较，*P〈〇. 01; #P〈〇. 001。
[0039] 5.实验结论 本发明的山蜡梅叶片可以抑制B16细胞增殖，减少B16细胞的细胞生长数目，该作用呈 剂量依赖性。
【主权项】
1. 山蜡梅叶片在制备抑制黑色素瘤细胞B16细胞增殖药物中的应用，所述山蜡梅叶片 由山錯梅叶1500g作为原料药制成，其特征在于，所述山錯梅叶片的制备方法由下列步骤组 成:取山蜡梅叶，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药·min，萃取时间 700-800min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成 500片，每片重0.35g。2. 根据权利要求1所述的山蜡梅叶片在制备抑制黑色素瘤细胞B16细胞增殖药物中的 应用，其特征在于，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成:取山蜡梅叶，加入到C02超 临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa， 温度40°C，C02流量2ml/g生药·min，萃取时间750min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加 入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
【专利摘要】本发明属于中药技术领域，具体涉及一种山蜡梅叶片在制备抑制黑色素瘤细胞B16细胞增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。所述山蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得槲皮素和山柰素含量有很大提高。
【IPC分类】A61K36/185, A61P35/00, A61K9/20
【公开号】CN105434487
【申请号】CN201510984152
【发明人】李晶, 杨志华
【申请人】济南新时代医药科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月24日