将实验细胞（A549、MRC-5)置于含5% C〇2的37°C培养箱中培养，待长满70%~ 90 %面积后，用0. 25 %膜酶邸TA消化，收集细胞，100化/min离屯、5min，倾去上清液，细胞沉 淀用含10%小牛血清的Μ p I 1640培养液打匀后接入25血培养瓶中，5m L每瓶，每周传 代2~3次。
[0120] W细胞培养基溶解测试药物，得到lOmg/ml的储备溶液。用培养基梯度稀释得到 64、32、16、8及4、2、l、0.5μg/ml浓度药物。人肺癌细胞A549细胞W100 00个/孔、人胚肺 成纤维细胞MRC-5细胞W 5000个/孔铺于96孔板中，4化后更换含相应浓度的培养基，每 个浓度6个复孔；同时设仅含培养基的孔为阴性对照，解育2地后吸掉各孔中的培养基，用 PBS清洗1~2次，更换含15% MTT的培养基，继续解育地。吸掉培养基，加入150ml DMSO， 低速振荡lOmin，用酶标仪检测490nm处吸光度，参考波长为630nm。抑制率采用W下公式 计算：
[0121]
[0122] 实施例1制备的马尾松嫩枝皮提取物对人肺腺癌细胞A549具有较强的生长抑制 作用，IC50值为4. 9 μ g/ml，而其在5mg/ml浓度下，对正常细胞MRC-5没有明显的毒副作 用。5-氣尿喀晚对人肺腺癌细胞A549的IC50值为2. 2 μ g/ml。结果见表2。
[0123] 表2马尾松嫩枝皮提取物对A549细胞的生长抑制作用
[0124]
[0125] 同法测定实施例2-6马尾松嫩枝皮提取物对A549细胞的生长抑制作用，测得其 IC50为3~7 μ g/ml，且对正常细胞没有明显的毒副作用。对照例1-2提取物对A549细胞 的抑制作用较差，IC50值均高于实施例1-6所述嫩枝皮提取物。
[0126] 实验结果表明，本发明的马尾松嫩枝皮提取物对肺腺癌细胞具有显著的生长抑制 作用，而对正常细胞没有明显的毒副作用。并且，马尾松嫩枝皮提取物对肺腺癌细胞的生长 抑制作用呈现明显的量效关系，即随着提取物浓度的增加，对细胞的生长抑制作用逐渐提 局。
[0127] 实施例9嫩枝皮提取物中抗癌活性成分研究
[012引对实施例2中马尾松嫩枝皮提取物溶液进行进一步处理，去除其中总碱和多糖， 获得与嫩枝皮提取物中多酪浓度相当的多酪提取物。测定两提取物对肺腺癌细胞株A549 的抑制活性差异，结果如下所示：
[0129] 表3本发明提取物与多酪提取物活性差异比较
[0130]
阳131] 由表3可见，本发明首次采取低溫超声水提取方法制得马尾松嫩枝皮提取物，该 提取物中含有除原花青素外的其他具有抑制肺腺癌活性的总碱、多糖等成分，运些有效成 分呈现了协同增效作用。
[0132] 连施例10马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂的制备
[0133] (1)马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂片忍的组成：
[0134] 马尾松嫩枝皮提取物 500g
[0135] 微晶纤维素 50g
[0136] 制得片忍1000片。
[0137] 似肠溶包衣液的组成：
[013引将包衣粉径丙基甲基纤维素化PMC)约20g W 95%乙醇为溶剂配制成浓度为9% 的包衣液225g (每500g药物需要包衣液225g)。
[0139] (3)马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂的制备方法，包括下述步骤：
[0140] 1)称取实施例2制得的马尾松嫩枝皮提取物500g，加入50g微晶纤维素，均匀混 合，按照粉末直接压片法，制备片忍1000片；
[01川。将进风溫度调至为85。出风溫度为50°C ;将片忍倒入包衣锅，开启转速为 1.5r/min，稍预热，至片床片子有溫感；开启喷液，注意包衣锅内片子的情况，适当调速至 化/min-3;r/min ;待片子上包有一层薄膜衣时，可W停止喷液，烘干3min，关闭热风，冷却出 锅。
[0142] 实施例η马尾松嫩枝皮提取物延长肺腺癌中晚期患者生存期的作用研究
[0143] 将实施例10制得的马尾松嫩枝皮提取物口服肠溶片剂，用于中晚期肺腺癌志愿 者的治疗。
[0144] 选取确诊患有中晚期肺腺癌的二十名志愿者成人患者，其中，Ξ名晚期患者已发 现癌症细胞的骨转移，四名晚期患者已发现癌症细胞的淋己结转移，两名晚期患者已发现 癌症细胞的胸椎转移。患者按照下述方式给药：500mg/粒/次，每次六粒，每日Ξ次，溫开 水送服。
[0145] 结果表明，二十名患者的存活时间平均延长2-5年，生存质量得到明显改善。
[0146] 综上，本发明首次采取低溫超声水提取方法制得马尾松嫩枝皮提取物，该提取物 中含有除原花青素外的其他具有抑制肺腺癌活性的总碱、多糖等成分，并在提取物中呈现 协同增效作用。本发明马尾松嫩枝皮提取物主要用于中晚期肺腺癌及淋己结、锁骨、肋骨、 胸椎、腰椎、骨盆的转移导致的并发症，其肿瘤抑制率高达93. 66~99. 58%，且具有毒副作 用小、安全性高等优点。
【主权项】
1. 一种用于防治肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：1)将马尾 松嫩枝皮粉碎至200-800目，制得马尾松嫩枝皮粉，其中，所述的马尾松嫩枝皮为马尾松枝 头枝条当年发出的嫩枝在春夏季节采摘得到；2)在4~25°C条件下，在马尾松嫩枝皮粉中 加入水，浸泡l-l〇h，其中，马尾松嫩枝皮粉与水的质量体积比为1 :2-1:15,制得马尾松嫩 枝皮粉水浸泡液；3)将马尾松嫩枝皮粉水浸泡液超声提取5min-2h，过滤，制得马尾松嫩枝 皮水提液；4)将马尾松嫩枝皮水提取液经干燥，即得。2. 根据权利要求1所述的制备方法，所述马尾松嫩枝皮粉碎前经筛选、除杂、烘干处 理，优选所述烘干温度为30~80°C，更优选为40-70°C，最优选为50-60°C。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，所述马尾松嫩枝皮粉碎至250-700目，优选为 300-600目，更优选为350-500目。4. 根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，所述提取温度为8-20°C，优选为 10-15。。。5. 根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，马尾松嫩枝皮粉与提取用水的质量体积 比为 1:4-1:12,优选为 1:6-1:10。6. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，所述提取物中有效成分包括多酚、总碱 和多糖，优选所述有效成分含有2-5%的多酚，15-25%的总碱和60-80 %的多糖，更优选含 有2. 39%的多酚、18. 07%的总碱和78. 6%的多糖。7. -种权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的马尾松嫩枝皮提取物。8. 根据权利要求16所述的马尾松嫩枝皮提取物，所述提取物中有效成分包括多酚、总 碱和多糖，优选所述有效成分含有2-5 %的多酚，15-25%的总碱和60-80%的多糖，更优选 含有2. 39%的多酚、18. 07%的总碱和78. 6%的多糖。9. 一种用于防治肺腺癌的药物组合物，所述的药物组合物由权利要求1-6任一项所述 的制备方法制得的马尾松嫩枝皮提取物或者权利要求7-8任一项所述的马尾松嫩枝皮提 取物和药学上可接受的载体组成。10. 权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的马尾松嫩枝皮提取物或者权利要求 7-8任一项所述的马尾松嫩枝皮提取物或权利要求9所述的药物组合物在制备用于防治肺 腺癌的药物中的应用，优选所述肺腺癌选自中晚期肺腺癌或其在淋巴结、锁骨、肋骨、胸椎、 腰椎、骨盆的任一部位的转移或其转移并发症。
【专利摘要】本发明涉及一种用于防治中晚期肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物及其制备方法与其组合物。所述提取物的制备方法包括下述步骤：1)将马尾松嫩枝皮粉碎至200-800目，制得马尾松嫩枝皮粉，其中，所述的马尾松嫩枝皮为马尾松枝头枝条当年发出的嫩枝在春夏季节采摘得到；2)在4～25℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入水，浸泡1-10h，制得马尾松嫩枝皮粉水浸泡液；3)将马尾松嫩枝皮粉水浸泡液超声提取5min-2h，过滤，制得马尾松嫩枝皮水提液；4)将马尾松嫩枝皮水提取液经干燥。本发明所述马尾松嫩枝皮提取物主要用于防治中晚期肺腺癌及其在淋巴结、锁骨、肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等部位的转移或其并发症，其肿瘤抑制率高达93.66～99.58％，且毒副作用小、安全性高等优点。
【IPC分类】A61K135/00, A61P35/00, A61K36/15
【公开号】CN105456307
【申请号】CN201510612024
【发明人】张映波, 王力
【申请人】中山未标生物新技术有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年9月23日