治疗和/或预防心血管疾病的抗pcsk9化合物和方法
【专利说明】治疗和/或预防心血管疾病的抗PCSK9化合物和方法
[0001 ] 相关申请的的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/789867的权益，其全部内容 通过引用并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004] 在国家心脏、肺和血液研究所(NHLBI)的支持下根据SBIR批准号HL092712作出本 发明。美国政府对本发明具有一定的权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)的生理作用的 化合物，包括其与低密度脂蛋白受体（LDLR)的相互作用。更具体地说，本发明涉及包含 PCSK9功能的小分子调节剂的组合物以及使用这些调节剂作为药物的方法。PCSK9功能的小 分子调节剂可在治疗上用于降低血液中的LDL-胆固醇水平，并且可以用于预防和/或治疗 胆固醇和脂蛋白代谢紊乱，包括家族性高胆固醇血症、导致动脉粥样硬化的血脂异常、动脉 粥样硬化，和更通常的，心血管疾病(CVD)。
[0006] 发明背景
[0007] 心血管疾病是导致死亡的原因，而动脉粥样硬化是心血管疾病的首要原因。动脉 粥样硬化是动脉的疾病并且导致与工业化国家的许多死亡相关的冠状动脉心脏疾病。现在 已确定冠状动脉心脏疾病的几个危险因素:血脂异常，高血压，糖尿病，吸烟，不良饮食习 惯，缺乏运动和压力。血脂异常是血浆胆固醇（高胆固醇血症)和/或甘油三酯（TGs)的提高 或低的高密度脂蛋白（HDL)水平，这促使动脉粥样硬化发病。它是一种经证明促进心血管疾 病的代谢疾病。在血液中，胆固醇在脂蛋白颗粒中运送，其中，低密度脂蛋白（LDL)胆固醇 (LDL-C)被认为是"坏的"胆固醇，而HDL-胆固醇(HDL-C)被称为"好的"胆固醇。由于胆固醇 对动脉粥样硬化的影响，脂质和脂蛋白异常在一般人群中极为常见，并且被认为是心血管 疾病的高度可改变的危险因素。虽然用他汀类药物治疗(护理动脉粥样硬化的现行标准）， 60-70%的心血管事件、心脏病发作和中风发生，因此，存在关于CVD的长期感到显著未满足 的需求。此外，新的指南建议应该实现更低的LDL水平以保护高危患者免受过早的CVD(l)。
[0008] 在PCSK9和胆固醇代谢之间的联系建立之后，很快就发现PCSK9基因中的选定突变 引起常染色体显性高胆固醇血症(2)，这表明突变通过增加 PCSK9的正常活动而赋予功能获 得(gain-〇f-function)(3)。这通过野生型和突变PCSK9(S127R和F216L)在小鼠的肝脏中高 水平地表达的实验得到支持;接受野生型或突变PCSK9的小鼠的肝LDLR蛋白水平急剧下降 (4，5)。未观察到LDLR mRNA水平的相关降低，表明突变或野生型PCSK9的过表达通过转录后 机制降低LDLR。
[0009] 由于PCSK9的功能获得型突变导致高胆固醇血症，那么产生功能缺失型突变是否 具有相反的效果并导致低胆固醇血症的疑问是合乎情理的。在非裔美国人中确定了 PCSK9 的三个功能缺失型突变(6)。这些突变降低LDL-C水平28%，并显示出降低CHD的频率(解释 为心肌梗塞，冠心病死亡或冠状动脉血管重建)88%。Rashid等人(7)研究了其中灭活PCSK9 的小鼠中功能缺失型突变的机制。他们报告说，这些基因敲除小鼠显示增加的肝脏LDLR蛋 白（而不是mRNA)，增加的循环脂蛋白的清除以及降低的血浆胆固醇水平。PCSK9的天然存在 的突变的结构功能关系分析也已经提供了对PCSK9的作用机制的深刻理解。有趣的是，被发 现与LDL-C血浆水平的最大降低相关的PCSK9的突变是通过扰乱其合成(Y142X)、自催化处 理(L253F)或折叠(C679X)而防止成熟PCSK9分泌的那些（8)。￥142乂突变不产生可检测的蛋 白，因为其早在转录时发生并且据预计启动无义介导的mRNA降解。催化结构域(L253F)的突 变干扰蛋白质的自催化切割。表达PCSK9-253F的细胞与表达PCSK9-WT的细胞相比，成熟蛋 白质的量降低，这表明突变抑制自催化切割。L253F突变接近催化三联体(PCSK9是一种丝氨 酸蛋白酶），因此它可能干扰活性位点（8)。由于蛋白质从ER输出需要PCSK9的自催化切割， L253F突变延迟PCSK9从ER传输到细胞表面。PCSK9中的无义突变(C679X)，其截断蛋白质14 个氨基酸，不干扰蛋白质加工，但成熟蛋白在细胞中积聚并且不分泌，这表明该蛋白正常地 裂解但被错误折叠，并保留在ER中（8，9)。
[001 0 ]尚未完全阐明PCSK9引起LDLR降解的机制。然而，很明显LDLR降解不需要PCSK9的 蛋白酶活性(IOdlhLi等人(10)已经共同表达了前结构域和反式的催化结构域，并表明所 分泌的PCSK9无催化活性，但在降低细胞LDL摄取和LDLR水平方面它功能上等同于野生型蛋 白。McNutt等人（11)也报道了类似的研究。此外，Zhang等人（12)已经绘制PCSK9结合到LDLR 的EGF-A重复，并且表明这样的结合降低了受体回收并增加其降解。他们还报道了与EGF-A 结构域的结合是钙依赖性的，并且随着PH从7降低到5.2显著地减少。最近，Kwon等人（13)确 定了与LDLR-EGF-AB(EGF-A和EGF-B)复合的PCSK9的晶体结构。该结构显示明确界定的EGF-A结构域，但EGF-B结构域是无序的并且未出现在它们的电子密度图中。EGF-A结构域在远离 催化位点的位点处与PCSK9催化结构域结合，并且不与C末端结构域或前结构域(14)接触。 [00 11]已经为靶向PCSK9提出了若干策略（15)。策略l:mRNA基因敲除方法包括使用反义 寡核苷酸或RNAi。对小鼠施用的反义寡核苷酸将PCSK9表达降低了 >90 %并且将血浆胆固醇 水平降低了53% (16)。对食蟹猴单次静脉注射在类脂质（Iipidoid)中递送的RNAi将血浆 PCSK9水平降低了70%并且将血浆LDL-C水平降低了56% (17)。策略2:用小分子、肽或针对 PCSK9的抗体防止PCSK9与LDLR在细胞表面上结合。添加 EGF-A片段到培养细胞抑制外源添 加的PCSK9介导LDLR降解的能力。策略3:开发PCSK9加工的小分子抑制剂。尽管有证据表明 LDLR降解不需要PCSK9的催化活性（II)，PCSK9催化活性的细胞内抑制剂应该是有效的，因 为蛋白质从ER分泌需要PCSK9的自催化加工。在其合成之后，PCSK9进行脱去前结构域的自 催化裂解反应，但前结构域仍然连接催化结构域（18，19) 1CSK9的分泌需要自催化加工步 骤(20)，可能是因为前结构域充当分子伴侣和促进折叠。前结构域的持续连接部分地阻断 PCSK9的底物结合口袋（18，19)。此灿《等人(21)证明分泌的？051(9的拮抗作用增加!1叩62细 胞中的LDLR表达。他们表明，导致功能获得型突变的m相关的LDLR等位基因（H306Y)是由于 PCSK9与LDLR的亲和力增加，这将导致增强的LDLR破坏，和降低的血浆LDL-C清除。另外，他 们能够优雅地表明用LDLR(H306Y)亚片段阻断分泌的PCSK9导致培养HepG2细胞的LDLR水平 的增加。因此，PCSK9充当引起LDLR降解的分泌因子，并且干扰自催化过程的小分子抑制剂 应该减少成熟分泌的PCSK9的量。本发明涉及使用策略3识别下调PCSK9的功能的小分子。 [0012]最近（22-24)，1^861161'〇11/3311〇;1^和411^611已经报道了证实单克隆抗体阻断？031(9 的第二阶段概念验证数据，作为使不受标准他汀类药物治疗控制的患者的LDL-C降低的策 略。他们报告说，单次注射他们称为REGN727的药物，在临床试验中削减LDL水平超过60%。 他们的方法遵循使用抗体而不是小分子的策略2。该策略2也正由 公司进行，而策略1正由Alnylam、Idera和Santaris进行（25)。
【发明内容】
[0013]本发明涉及选择性地与PCSK9功能相互作用并且下调PCSK9功能的小分子。在第一 实施方案中，在本发明的实行中使用的试剂具有下面的通式：
[0015] 其中R1J2和R3独立地选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、环烷基、芳基、杂环和 杂芳基组成的组；
[0016] X是0和NR4; R4选自由H和低级烷基组成的组；
[0017] A是〇)、〇)顺5、302、(：（=0)-0或到1?1的价键 ;1?5选自由!1和低级烷基组成的组；
[0018] M是CO和CR6R75R6和R7独立地选自由H、低级烷基组成的组；
[0019] Q选自由〇和NR8组成的组;R8选自由H、低级烷基组成的组，或任选地当X是NR4并且Q 是NR8时，R4和R8以及R4和R8各自均连接的氮原子形成任选取代的5或6元杂环，如由 (CRa)n 表示的，其中Ra代表H或低级烷基并且n= 1或2;及所述化合物的药学上可接受的 盐和所有的立体异构体。式I的化合物被认为是新的化合物，除了 [(3-氯-4-甲基苯基)氨基 甲酰基](苯基）甲基4-(氨基甲酰基氨基)苯甲酸酯之外。
[0020] 在一个实施方案中，本发明提供了在需要这种治疗的患者中治疗或预防高胆固醇 血症和/或血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状的方法，包括 对这样的患者施用治疗有效量的具有以上式I的化合物。
[0021] 在另一个实施方案中，在需要这种治疗的患者中治疗或预防高胆固醇血症和/或 血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状的本方法通过对需要这 种治疗或者预防的患者施用以下化合物的至少一种来实行：
[0023]其中，X1J1和Z1相同或不同并且各自表示氢或选自由羟基、卤素、氨基、烷氧基、羧 基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基氨基、单烷基氨基羰基氨 基、二烷基氨基羰基氨基、氨基甲酸酯（carbamato)、酰胺基（carboxamido)、单烷基氨基亚 磺酰基、二烷基氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟 基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷 基、单烷基氣基横醜基烷基、^烷基氣基横醜基烷基、单烷基氣基亚横醜基烷基、^烷基氣 基亚磺酰基和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组的取 代基；
[0024] X是0和NR4; R4选自由H和低级烷基组成的组；
[0025] A是(XKCONR5和S02;R5选自由H和低级烷基组成的组。
[0026]在上述方法的替代实施方案中，对需要这样的治疗或预防的患者施用下列化合物 中的至少一个：
[0030] 其中，在每个式III、IV和V中，X1J1和Z 1可以相同或不同并且各自表示氢或选自由 羟基、卤素、氣基、烷氧基、駿基、氣基幾基氣基、单烷基氣基幾基氣基、^烷基氣基幾基氣 基、氨基甲酸酯、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基氨基、单烷基 氨基羰基氨基、二烷基氨基、羧基氨基、氨基甲酸酯、酰氨基、单烷基氨基亚磺酰基、二烷基 氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺酰氧基、烷 氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单烷基氨基磺 酰基烷基、二烷基氨基磺酰基烷基、单烷基氨基亚磺酰基烷基、二烷基氨基亚磺酰基和任选 取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组的取代基;R 9选自由H、 ORiq和NR1V1组成的组;Riq和R 11独立地选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、芳基、杂芳基 或杂环组成的组，或者一起形成任选取代的杂环。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明的方法涉及施用具有下式的至少一种化合物：
[0033] 其中X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氢或选自由羟基、卤素、氨基、烷氧 基、駿基、氣基幾基氣基、单烷基氣基幾基氣基、^?烷基氣基幾基氣基、氣基甲酸醋、醜氣基 (包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、单烷基氨基亚磺酰基、二烷基氨基亚 磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺酰氧基、烷氧基磺 酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单烷基氨基磺酰基烷 基、二烷基氨基磺酰基烷基、单烷基氨基亚磺酰基烷基、二烷基氨基亚磺酰基和任选取代的 低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组的取代基;R 12选自由H和任选取 代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组；
[0034] A 是 CO 和 SO2;
[0035] Y 是H2或0。
[0036] 在最后提到的实施方案中，施用的化合物可以是下式的至少一种：
[0038] 其中，X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氢或选自由羟基、卤素、氨基、烷氧 基、羧基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、单烷基氨基亚磺酰 基、二烷基氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺 酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单 烷基氣基横醜基烷基、^烷基氣基横醜基烷基、单烷基氣基亚横醜基烷基、^烷基氣基亚横 酰基和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组的取代基； R12选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组;R13 选自由H、0R14和NR14R15组成的组;R14和R 15独立地选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、芳 基、杂芳基或杂环组成的组，或者当连接到氮原子时一起形成任选取代的杂环；
[0039] A 是 CO 和 SO2;
[0040] Y 是H2或0。
[0041]在本发明另一实施方案中，所施用的化合物可以是具有式VIII的化合物：
[0043] 其中，X1J1和Z1可以相同或不同并且各自表示氢或选自由羟基、卤素、氨基、烷氧 基、羧基、酰氨基(包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、酰胺基、单烷基氨基亚磺酰 基、二烷基氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺 酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单 烷基氣基横醜基烷基、^烷基氣基横醜基烷基、单烷基氣基亚横醜基烷基、^烷基氣基亚横 酰基和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组的取代基； R16选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组;A是 ⑶和SO 2;并且Y是出或0。在式VIII的一个优选的实施方案中，X1J1和Z1中的至少一个是4-NHCOR 17;其中R17选自由H、OR18、和NR18R 19组成的组;R18和R19独立地选自由H和任选取代的低 级烷基、烯基、芳基、杂芳基或杂环组成的组，或当连接于氮原子时一起形成任选取代的杂 环。
[0044] 在另一个方面，在本发明的实行中使用的试剂可具有以下通式：
[0046]其中R2Q、R21和R22独立地选自由H和任选取代的低级烷氧基、烷基氨基、烷基、烯基、 环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组；
[0047] X是0和NR23; R23选自由H和低级烷基组成的组，或任选地与Q或R1以及它们各自都连 接的原子一起形成任选取代的5或6元环；
[0048] A是(》、〇)顺24、302、(：（=0)-0或到1?2()的价键 ;1?24选自由!1和低级烷基组成的组；
[0049] M是CO和CR25R26;R25和R26独立地选自由H、低级烷基、到Q的键组成的组，或任选地与 R22和它们各自都连接的原子一起形成任选取代的芳基、杂芳基或杂环；
[0050] Q选自自由0、NR27或到R22的价键组成的组;R27选自由H、低级烷基组成的组，或任选 地当X为NR 23且Q是NR27时，R23和R27以及R23和R 27各自都连接的氮原子形成任选取代的5或6元 氮原子杂环，如 (CRa)n---表示，其中Ra表示H或低级烷基且n= 1或2;以及该化合物的药 学上可接受