用于组织再生的组织支架材料和制造方法
【专利摘要】本发明公开了组织支架材料，所述组织支架材料具有一种密度的微球，所述微球嵌埋在不同密度的水凝胶中。所公开的材料具有改善的能力以促进用于伤口愈合和组织再生的细胞侵袭和血管形成。发明人已发现具有不同密度的组分的材料促进细胞侵入所述支架，所述细胞包括所需的细胞，例如成纤维细胞和内皮前体细胞。
【专利说明】用于组织再生的组织支架材料和制造方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年11月19日提交的美国临时申请61/906,131的优先权，其在此 整体并入本发明。
[0003] 公开背景
[0004] 通过自体或人工组织支架来优化细胞指导长期以来是一个令人感兴趣的主题。最 为流行且因此最为长久成功应用的现成"组织工程化"产品均最初意在用作真皮替代支架。 市售的支架是非细胞的，且因此需要同时满足宿主细胞侵袭以及血管形成的要求，以实现 持久的结合。因为此过程是比较久的，最少需要数周完成并需要必要的换药、伤口固定和护 理，所以令人非常感兴趣的是发展可优化细胞侵袭率的更好的支架（Eppley，Plast Reconstr Surg. 107:757-762(2001) ;Wong等人，Plast Reconstr Surg. 121:1144-1152 (2008))〇
[0005] 当前可获得的非细胞真皮替代物可分为两大类:来源于脱细胞真皮的产品、以及 基于天然来源的水凝胶的合成产品（Truong等人，J.Burns Wounds 4:e4(2005))〇
[0006] 市售的脱细胞真皮产品由脱细胞的尸体猪或人真皮制得。由于脱细胞过程，这些 产品包含具有完整基底膜的微通道内部网络，其为天然真皮微血管的残留部分。
[0007] 另一常用的真皮再生模板INTEGRA( Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)包含 由"表皮"半渗透性硅酮片层覆盖的交联I型牛胶原和软骨素-6-硫酸盐的合成"真皮"多孔 层。植入后，一旦真皮层已血管化，则用刃厚自体移植物替代娃酮片(Yannas等人，Science 215:174-176(1982))。不同于脱细胞真皮产品，INTEGRA是不具有内部血管结构的代表性产 品，而其特征在于其无规的孔隙度（平均孔径30_120ym)(van der Veen等人，Burns 36: 305-321(2010))。
[0008] 使用当前可获得的组织替代支架的相关成本很高。例如，脱细胞真皮产品的制造 需要组织的采集和收获，以及脱细胞和灭菌过程(Ng等人，Biomaterials 25:2807-2818 (2004))。此外，市售的组织支架是无血管的，且当在复杂条件下(例如被辐照的伤口或具有 暴露硬件或骨的那些)使用时易于发生高失败率。在此类复杂条件下，使用现有组织替代产 品不足以形成新血管。
[0009] 本领域高度需要改善的组织支架，所述组织支架促进新的周围组织的优化的细胞 侵袭和血管形成。
[0010] 发明公开概述
[0011] 本发明公开的是一类组织支架材料，其由具有嵌埋的微球的水凝胶制成。在所公 开的组织支架中，微球具有相对于水凝胶密度不同或更大的聚合物密度(w/v)，该差别密度 促进细胞侵入组织支架。在一个实施方式中，水凝胶包含第一聚合物且微球包含第二聚合 物，微球嵌埋在水凝胶中，且微球具有大于水凝胶的密度。
[0012] 第一和第二聚合物可独立地选自由以下构成的组:胶原、明胶、弹性蛋白、透明质 酸盐、纤维素、纤维蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚（乳酸） (PLA)、聚（己内酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚（三亚甲基碳酸酯）、聚（对二氧环己酮)和聚（对 苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基）丙烷-癸二酸]、聚[对苯二酸双 (羟乙基）酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚（氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二 醇）、微生物聚酯、聚(β-羟基链烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在实施例中，微球可包含 0.2%至2.0%、0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%?八的第二聚合物。在一个特定实施例 中，第二聚合物是胶原。微球的直径可介于50-250μπι之间。微球可占组织支架材料的至少约 50体积％、60体积％或70体积％。微球还可包含生物活性因子，但在一些实施方式中，微球 不包含生物活性因子。生物活性因子可促进细胞侵袭、细胞生长或血管形成中的一种或多 种。
[0013] 在一个实施例中，水凝胶包含胶原。在一些实施例中，水凝胶包含0.1 %至0.6 %、 0.2至0.4 %或0.3 % w/v的量的胶原。组织支架材料可具有如下微球:所述微球具有0.2 %至 2.0%、0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%￥八的胶原，并嵌埋在具有0.1%至0.6%、0.2 至0.4%或0.3% %w/v胶原的水凝胶中。在一个实施方式中，组织支架材料具有如下微球， 所述微球具有〇. 6-1.0%w/v的胶原，并嵌埋在包含0.3%w/v胶原的水凝胶中。
[0014] 以上实施方式中的任意者的组织支架材料可为片材形式或为可流动形式。材料可 为例如厚度为〇. 5-3.0_或约1.0-2.0_的片材形式。所公开的组织支架材料可用于受试者 的伤口愈合或组织再生的方法中。
[0015] 本发明进一步公开的是通过将如上或在此公开的组织支架材料施用至有需求的 受试者的伤口或组织，从而在所述受试者中促进伤口愈合或组织再生的方法。可将所述组 织支架材料施用至例如受试者的具有外露骨、硬件或坏死组织的区域。
[0016] 本发明还公开的是制造组织支架材料的方法。所述方法包括以下步骤：（a)提供具 有微球的第一组合物和具有聚合物材料的第二组合物，所述第一组合物具有与所述第二组 合物不同的密度；（b)混合第一和第二组合物;和(c)使聚合物材料在混合物中交联，以形成 具有嵌埋微球的水凝胶。第一和第二组合物可各自包含胶原(例如人胶原或牛胶原)作为聚 合物。胶原可为经中和的胶原。微球可包含〇. 4%至1.2 %、或0.6-1.0 % w/v的胶原。微球可 进一步包含生物活性因子。第二组合物可包含0.1 %至0.6%、或0.3%w/v的胶原。交联可通 过例如热方法完成。
[0017]还公开的是通过以上提供并在本文进一步公开的方法制得的组织支架材料，以及 包含此类组织支架材料的伤口敷料。
[0018] 附图简述
[0019] 本专利或申请文件包含至少一幅彩图。当需要并支付必需费用时，具有彩图的此 专利或专利申请公开的副本将由事务所提供。
[0020] 图1A-1C.植入后7天时，细胞浸润MSS支架（C)，但未浸润单独的1%本体(bulk) (A)，且极少浸润0.3 %本体(B)。
[0021] 图2A-2C.移植后14天时，细胞显示出极好的MSS支架浸润(C)，但未浸润超出1 %本 体的外部(A)，且仅显示出适中的0.3%本体浸润(B)。
[0022] 图3A-3D.移植后7天时，对于在0.3 %本体中具有1 %微球的MSS支架(C)和在0.3 % 本体中具有〇. 6%微球的MSS支架(D)，细胞显示出更完全的浸润，对于在0.6%本体中0.4% 微球(A)和在0.2 %本体中0.4 %微球(B)，细胞显示出较少的浸润。
[0023] 图4A-4B.移植后7天和14天时，在0.3 %本体中1 %微球的细胞浸润(蓝染，DAPI)包 含内皮前体细胞CD31+细胞(红染）。
[0024] 图5A-5D.移植后7天时。（A-C)，在小鼠中的MSS、0.3%本体、1%本体和INTEGRA支 架的确认。(D)，移植后支架的相对尺寸。
[0025] 图6A-6C.移植后7天，细胞浸润MSS支架直至支架的中心(A)，但未浸润1 %本体(B) (除了支架裂开处外），且极少浸润3 %本体(C)。
[0026]图7.移植后7天。DAPI核染(蓝色)证实了细胞侵入MSS的中心以及CD31 +内皮前体 细胞(红色）。
[0027] 图8A-8E.移植后14天。（A-D)，在小鼠中的MSS、0.3 %本体、1 %本体和INTEGRA支架 的确认。(E)，移植后支架的相对尺寸。
[0028]图9A-9D.移植后14天。（A)，MSS支架中显著的细胞侵袭。（B)，具有最小侵袭（除沿 着裂纹外）的1 %胶原。（C)，具有零星侵袭的0.3%胶原支架。（D)，在14天时INTEGRA也具有 较小的表观侵袭。
[0029]图10.每单位支架面积的细胞计数显示出在7天和14天时，相对于1 %水凝胶(每单 位面积约3个和5个细胞)和0.3%水凝胶(每单位面积约3个和7个细胞），显著更多的细胞侵 入所述MSS支架(每面积分别约7个细胞和10个细胞）。
[0030] 图11A-11D.移植后28天。（A-C)，在小鼠中的MSS、0.3%本体、1 %本体和INTEGRA支 架的确认。(D)，移植后支架的相对尺寸。注意0.3%水凝胶显著收缩。
[0031] 图12A-12D.移植后28天。（A)，MSS支架中极好的细胞侵袭。（B)，1 %胶原维持最小 侵袭(除沿着裂纹外）。（C)，0.3%胶原支架显示出均匀适中的侵袭。（D)，INTEGRA也显示出 合理的侵袭。
[0032]图13.微球的扫描电子显微镜图像。
[0033] 公开详述
[0034] 本文公开的是组织支架材料，其具有改善的能力以促进用于伤口愈合和组织再生 的细胞侵袭和血管形成。发明人已发现具有不同密度的组分的材料促进细胞(包括所需的 细胞，例如成纤维细胞和内皮前体细胞)侵入所述材料。
[0035] 术语"组织支架"、"组织支架材料"、"真皮替代物"、"真皮替代材料"和"材料"在本 文中可互换使用，指的是由生物相容性聚合物制得的细胞生长支持结构。这些材料能够通 过提供促进细胞侵袭和组织再生的生物相容性模板而再生受损组织。
[0036] 本文公开的组织支架材料由填充有微球的水凝胶支持物组成。微球具有与其所嵌 埋于其中的水凝胶不同的密度(所述密度测量为重量/体积或w/v)。在一个优选实施方式 中，微球具有大于水凝胶的密度。然而，微球可具有小于水凝胶的密度。
[0037] 在本申请全文中，术语"约"和"大约"表明某值包含装置、用于测定所述值的方法 的固有误差变化，或者存在于研究受试者中的变化。在一个非限制性实施方式中，所述术语 被定义为在10%以内，优选5%以内，更优选1%以内，且最优选0.5%以内。
[0038] 聚合物
[0039]本发明所公开的微球、水凝胶和组合物包含聚合物。微球和水凝胶可包含相同聚 合物，或可包含彼此不同的聚合物。"聚合物"是由重复亚单位组成的大分子。用于组织工程 的适宜的聚合物材料包括天然聚合物，例如胶原、明胶、弹性蛋白、透明质酸盐和纤维素;纤 维蛋白原；以及合成聚合物，包括聚酯（例如聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸） (卩6六）、聚（乳酸）（？1^)、聚（己内酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、聚(对二氧 环己酮)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯））；聚酯酰胺(例如HYBRANE S1200(DSM，荷兰））；聚氨酯 (例如DEGRAPOL(Abmedica，意大利））；聚酸酐（例如聚[(羧基苯氧基）丙烷-癸二酸]);聚磷 酸酯（例如聚[对苯二酸双(羟乙基)酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]);聚（原酸酯）；聚(氰基 丙烯酸烷基酯）；聚醚(例如聚（乙二醇））；微生物聚酯(例如聚(β_羟基链烷酸酯））；以及聚 (氨基酸）（例如酪氨酸衍生的聚碳酸酯）（综述参见131"；[11等人，1111:.]\他11〇1116(1.8:3071-3091(2013))。在一个实施方式中，所述聚合物选自由以下构成的组:胶原、透明质酸、聚（乳 酸-共-乙醇酸）(PLGA)、聚（乙醇酸）(PGA)和聚(乳酸）(PLA)。优选的聚合物是胶原和基于胶 原的生物材料，包括1、11、111、1￥和￥型胶原。特别优选在人类受试者中使用人胶原和牛胶 原，例如人I型胶原或牛I型胶原。
[0040] 微球
[0041] "微球"是由聚合物制成的小颗粒。如本文所使用的术语"微球"包括可为球形或非 球形的小颗粒;因此，本申请中任何提及的"微球"可与术语"微结构"互换使用，因为本文所 公开的微球同时包括球形和非球形小颗粒。虽然微球可包含lwn-lmm的任意直径，但如本文 所公开的微球通常具有例如介于10-500μηι之间的直径、介于50-250μηι之间的直径、介于50-150μηι之间的直径或介于100-200μηι之间的直径。在一个实施方式中，组织支架材料中的微 球的尺寸和形状相当均匀，例如，给定支架中的所有微球大体上可为球形，并具有约50-150 μπι的直径，或约100-200μπι的直径。在另一实施方式中，给定支架中的微球的形状可不同，例 如，一些可为扁平、弯曲、长圆或不规则形状，而其它可为球形。在另一实施方式中，给定支 架中的微球的尺寸可不同，例如，尺寸不同可为10-500μηι直径、或甚至1 -1 ΟΟΟμπι直径。
[0042] 在一些实施例中，微球由0.2%至2.0%、0.4%至1.2%、0.4%至0.8%、或0.2%、 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、或1.0%￥八的选自以下的聚合物制得:胶 原、明胶、弹性蛋白、透明质酸盐、纤维素、纤维蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙 醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己内酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、聚(对 二氧环己酮)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二 酸]、聚[对苯二酸双(羟乙基)酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]、聚(原酸酯）、聚(氰基丙烯酸 烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_羟基链烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一个 特定实施方式中，聚合物是胶原。
[0043] 除聚合物外，微球可进一步包含生物活性因子。"生物活性因子"可为可刺激或促 进以下一项或多项的有机小分子、核酸或多肽:细胞侵袭、细胞生长、血管生成、血管形成、 神经再生或细胞分化。生物活性因子可为例如，在制备组织支架材料之前包含在微球内或 与微球的聚合物基质混合的生长因子。在一个实施例中，生物活性因子是选自由以下构成 的组的生长因子：神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、血小板衍化生长因子 (TOGF)、神经营养因子-3(ΝΤ-3)、脑源性生长因子(K)NF)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子 (FGF)、色素上皮细胞衍生因子(PEDF)、神经胶质衍生生长因子(GDNF)、血管生成素和红细 胞生成素(ΕΡ0)。在另一实施例中，生物活性因子是核酸，例如反义siRNA分子。在其它实施 方式中，微球不包含其它生物活性因子。
[0044]水凝胶
[0045]术语"水凝胶"是指在水中大量溶胀却不溶于水的广泛类别的聚合物材料。通常， 通过在以下条件下在水溶液中聚合亲水性单体而形成水凝胶:聚合物变得交联，从而形成 足以胶凝溶液的三维聚合物网络。水凝胶更详细地描述于Η 〇 f f m a η，D. S.，〃 Ρ ο 1 y m e r s i η Medicine and Surgery，''Plenum Press，New York，pp 33-44( 1974)中。
[0046]本文所公开的水凝胶可由以上提供的聚合物组成。在实施例中，水凝胶包含0.1% 至0.6 %、0.2至0.4%或0.3 % w/v的选自由以下构成的组的聚合物:胶原、明胶、弹性蛋白、 透明质酸盐、纤维素、纤维蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚（乳 酸）（PLA)、聚（己内酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、聚(对二氧环己酮)和聚 (对苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[对苯二酸 双(羟乙基)酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二 醇）、微生物聚酯、聚(β-羟基链烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一个实施例中，水凝胶 包含胶原。在一些实施例中，水凝胶包含0.1 %至0.6%、0.2至0.4%或0.3 %w/v的量的胶 原。
[0047]制造组织支架材料的方法
[0048] 本发明还公开的是制造组织支架材料的方法。所述方法包括以下步骤：（a)提供具 有微球的第一组合物和具有聚合物材料的第二组合物，第一组合物具有与第二组合物不同 的密度；（b)混合第一和第二组合物;和(c)使所述聚合物材料在所述混合物中交联，以形成 具有嵌埋微球的水凝胶。
[0049] 为制造支架，将适合的聚合物掺入用于制造的组合物中。适合的聚合物包括天然 聚合物，例如胶原、明胶、弹性蛋白、透明质酸盐和纤维素;纤维蛋白原;和合成聚合物，包括 聚酯(例如聚(乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己内酯）、聚 (琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、聚（对二氧环己酮）和聚(对苯二甲酸丁二醇酯））； 聚酯酰胺（例如HYBRANE S1200 (DSM，荷兰））；聚氨酯（例如DEGRAP0L(Abmedica，意大利））； 聚酸酐(例如聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]);聚磷酸酯(例如聚[对苯二酸双(羟乙基)酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]);聚（原酸酯）；聚（氰基丙烯酸烷基酯）；聚醚（例如聚（乙二 醇））；微生物聚酯（例如聚(β_羟基链烷酸酯））；和聚（氨基酸）（例如酪氨酸衍生的聚碳酸 酯）（综述参见Marin等人，Int.J.Nanomed. 8: 3071-3091 (2013))。在一个实施方式中，所述 聚合物选自由以下构成的组：胶原、透明质酸、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸） (PGA)和聚(乳酸）（PLA)。优选的聚合物是胶原和基于胶原的生物材料，包括I型、II型、III 型、IV型和V型胶原。特别优选的是人胶原和牛胶原。牛I型胶原是市售的，例如来自Life Technologies，Inc ·。人I型胶原可例如作为VITR0C0L(Advanced Biomatrix，Inc ·，San D i e go，Ca 1 i for n i a)以冻干形式或溶液获得。重组人胶原可例如作为COLLAGE胶原 (CollPlant Ltd.，Ness_Ziona，以色列）获得。
[0050] 胶原可源自各种来源，例如人组织或牛组织。胶原可为被给予组织支架的受试者 自体的，并可提取自例如所述受试者的皮肤。一旦获得适合的生物样本(例如皮肤、胎盘、肌 腱或培养细胞），则可通过已知技术从所述样本中提取胶原以形成原液。参见例如Epstein， J. Biol. Chem. 249:3225-3231 (1974)。胶原原液可在适当溶液中包含胶原，所述溶液包含例 如0.1 %醋酸、或者厄尔盐或汉克盐、L-谷氨酰胺、HEPES和碳酸氢钠。适当介质的一个例子 是Medium 199(M199)基介质。此介质可购自例如Sigma-Aldrich、Life Technologies和其 它细胞培养介质供应商。胶原通常保持在高于最终浓度的储备浓度下，例如对于水凝胶为 0.2 % -1.6 %胶原浓度，优选0.3-0.5 %胶原，对于微球为0.6-2.0 %胶原。适于用于所公开 的方法中的胶原也是市售的。
[0051] 在一些实施方式中，在使用前中和胶原。可通过混合胶原原液与氢氧化钠以达到 ρΗ7.2-7.6，优选pH 7.4来中和胶原。此混合物可用油（例如矿物油）覆盖，优选每体积的具 有NaOH的胶原至少5体积的油，并冷藏储存直至使用。
[0052] 为制造微球，高速混合具有油覆盖层的聚合物(例如，胶原)组合物以形成水包油 乳液。所述聚合物组合物可进一步包含至少一种类型的如上文所公开的生物活性因子。然 后采用增加浓度的乙醇重复洗涤所述乳液，例如，首次洗涤采用50 %乙醇，第二次洗涤采用 80%乙醇，第三至第五次洗涤采用100%乙醇。首次洗涤包括与每体积胶原溶液至少5体积 的乙醇混合(例如通过在800-1500rpm下混合20-40分钟），在2500-3500rpm下离心混合物δ-? 〇 分钟 ，并 除去油 和醇层 。随后 的洗涤 包括与 每体积 胶原溶 液至少 5 体 积的乙 醇混合 ，在 2500-3500rpm下离心混合物5-10分钟，并除去醇层。在醇洗后，接着用至少5体积的冷盐水 (例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))洗涤胶原3-5次。在除去最后的盐水洗液后，通过洗涤而形成 的胶原微球组合物即可备用。
[0053] 用于水凝胶的聚合物可与用于制造微球的聚合物相同或不同。在一些实施方式 中，用于水凝胶的聚合物与用于微球的聚合物相同。在其它实施方式中，用于水凝胶的聚合 物与用于微球的聚合物不同。在一个优选实施方式中，用于微球和水凝胶的聚合物均为胶 原。然而，无论微球和水凝胶是否具有相同或不同的聚合物，微球中的聚合物密度(w/v)将 不同于水凝胶"本体"中的聚合物密度(w/V)。
[0054] 为制造胶原水凝胶"本体"支架，混合胶原原液与氢氧化钠以达到pH 7.2-7.6，优 选pH7.4。然后此胶原组合物即可备用。
[0055] 为制造组织支架材料，将包含微球的第一组合物添加至模具或成形平台。将包含 聚合物材料的形成水凝胶的第二组合物添加加至第一组合物。例如通过搅拌或移液混合所 述组合物，以实现均匀混合。然后通过适用于交联聚合物的标准方法(例如通过热方法(在 35-45Γ，优选37°C下培养20-40分钟)或化学方法)交联所述混合物。交联后，组织支架材料 可立即使用或存作将来使用。
[0056]组织支架和敷料
[0057]还公开的是通过本文提供的方法制造的组织支架材料。制造组织支架的微球和水 凝胶各自包含选自由以下构成的组的聚合物:胶原、明胶、弹性蛋白、透明质酸盐、纤维素、 纤维蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己内酯）、 聚(琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、聚(对二氧环己酮)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯）； 聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[对苯二酸双(羟乙基)酯-正磷酸乙 酯/对苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_ 羟基链烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一个实施方式中，所公开的组织支架材料的微 球和水凝胶各自包含胶原（例如人胶原或牛胶原）作为聚合物。所述胶原可为经中和的胶 原。所述组织支架材料可为适用于注射入受试者的可流动形式，或为片材形式，例如厚度为 0.5_3. Omm，或 l_2mm 的片材。
[0058]在特定实施例中，组织支架材料可具有如下微球:所述微球具有0.2%至2.0%、 0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%￥八的胶原，并嵌埋在具有0.1%至0.6%、0.2至0.4% 或0.3% %w/v胶原的水凝胶中。微球具有不同于(通常大于)水凝胶的密度。密度之间的差 异应至少为25%。在一些实施方式中，当相对于胶原密度比较微球密度时，所述差异为至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多。在一个实施方式中， 组织支架材料具有如下微球:所述微球具有0.6-1.0 %w/v的胶原，并嵌埋在包含0.3 %w/v 胶原的水凝胶中。在另一个实施方式中，微球占组织支架材料的体积的至少约50%、60%或 70%。在进一步的实施方式中，微球包含生物活性因子，例如生长因子。
[0059] 进一步公开的是伤口敷料和医疗产品，所公开的组织支架材料被整合至所述伤口 敷料和医疗产品中。组织支架材料可嵌埋入敷料中，或沉积在敷料的一面上。敷料可进一步 包含一种或多种硅酮、纱布或其它覆盖物，和/或抗生素、抗炎剂或镇痛剂或其它药膏以促 进治愈或减少疼痛。
[0060] 组织支架产品可进一步适当地包装(例如在无菌包装中），以用于伤口愈合或组织 再生。
[0061 ]治疗方法
[0062] 本发明进一步公开的是通过将如本文所公开的组织支架材料施用至有需求的受 试者的伤口或组织在所述受试者中促进伤口愈合或组织再生的方法。可将组织支架材料施 用至例如受试者的期望组织再生的任何区域，例如施用至开放伤口或在外科手术过程期 间。在优选实施方式中，将所公开的组织支架施用至具有外露骨、硬件或坏死组织的机体区 域。
[0063] 本文所公开的组织支架可移除或原位保留。聚合物可为生物可降解的，且在此类 情况下其将逐渐溶解，留下新的细胞网络和由受试者的细胞形成的血管。
[0064]如本文所使用，术语〃受试者〃和〃患者〃可互换使用，并且是指动物，包括哺乳动 物，例如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、鼠等)和灵长类(例如猴和人）。
[0065]通过以下非限制性实施例进一步阐释本公开。 实施例
[0066]实施例1.微球/水凝胶支架的制造。
[0067]使用标准技术从鼠尾样本提取I型胶原。使用锐剥离从鼠尾移除皮肤并将其丢弃。 然后，从尾部远端开始，通过破坏椎骨内关节并上拉远端椎骨直至具有附接肌腱的远端椎 骨从剩余近端尾部分离，从而提取肌腱。然后将椎骨从肌腱锐剥离并将其丢弃。之后，将肌 腱置于70 %乙醇中。重复此过程直至尾内的所有关节均被破坏且肌腱被提取。收集所提取 肌腱、称重并置于无菌1L容器中。此后，将0.1 %醋酸添加至肌腱以达到75ml醋酸/g肌腱的 最终浓度，以便获得15mg/mL(l.5%w/v)I型胶原的胶原原液。然后将胶原原液贮存在4C下， 并每日搅动约1分钟，持续至少72小时。
[0068] 72小时后，将胶原原液等分入50mL圆锥管中，在4°C和8800rpm下离心90分钟，并移 除和弃去任意丸粒。然后将最后的15mg/mL(l .5%w/v)胶原原液置于标准冻干器中并冻干 至少72小时。冻干后，在-4°C下贮存胶原原液直至使用。一旦使用，将该冻干胶原重悬浮于 0.1 %醋酸中至1 Omg/mL(1 % w/v)的浓度。使用前每日搅动该重悬浮胶原（约1分钟），持续3 天。1.5% (w/v)胶原和0.384% (w/v)胶原的原液分别用于产生微球和0.3%水凝胶。
[0069] 为中和胶原以制造 1%微球，在冰上混合2ml 1.5%胶原与656μ1 IX M199介质 (Gibco/Life Technologies,Inc.)、300yl 10XM199介质和44μ1 NaOH(或根据需要更多的 NaOH以调节pH至7.4)。用至少5倍体积(例如15ml)的矿物油覆盖该混合物，并在4°C下贮存 直至使用。
[0070] 为制造微球，通过高速涡旋混合具有油覆盖层的经中和的胶原约5分钟，以产生油 包水乳液。然后将乳液倾入烧瓶，与每体积的减去油的胶原溶液至少5体积的50%乙醇合 并，并用搅拌子在llOOrpm下搅拌30分钟。然后将经搅拌的混合物倒入50ml的管中，并在 3200rpm和4°C下离心7分钟以形成油层和乙醇层，在所述油层和醇层间具有胶原薄层。除去 油层和醇层，用5体积的80 %乙醇洗涤胶原层，如上涡旋和离心，除去醇层，用5体积的100 % 乙醇洗涤，涡旋和离心，并除去醇层。然后用5体积的冷PBS洗涤胶原三回合，涡旋和离心，并 除去PBS。此过程期间，胶原微球形成。
[0071] 为制备用于水凝胶的胶原"本体"，在冰上混合391μ1 0.384%胶原与50.8μ1 IX 皿199介质、5(^11(^1199介质和8.6以1他0!1(或根据需要更多的似0!1以调节?!1至7.4)。然 后可使用此混合物如下制造支架。
[0072]为制造支架，使用具有7mm直径和2.5mm深度的模具产生约96mm3的支架。为制造微 球支架，将通过以上方法制造的微球吸移入各孔中至充填各孔约半满。每孔加入一滴胶原 本体，并通过搅拌与微球混合以形成嵌埋微球的水凝胶。然后在37°C下固化支架30分钟。在 经固化的支架上覆盖磷酸盐缓冲盐水(PBS)以防止进一步干燥。为制造"本体"支架，在没有 微球的情况下将胶原本体加至模具至与具有微球的支架大致相同的水平。如上固化支架并 使用PBS覆盖。
[0073] 根据开普勒密堆积球体猜想，支架体积的约74%应包括较高密度的微球，本体胶 原水凝胶占据其余体积。
[0074] 实施例2.含微球的支架促进细胞浸润。
[0075] 在植入前一天制造支架。将支架皮下植入8周龄野生型C57bl/6小鼠的背部。3只小 鼠移植如下总共4个支架:两个为在0.3 %本体支架中1 %微球;一个1 %本体支架作为对照； 一个0.3%本体支架作为对照。7或14天后处死并收获所有小鼠用作组织学分析。在埋入最 佳切割温度复合物(0CT)介质中的组织样本上进行苏木精和伊红(H&E)染色以确认细胞浸 润入支架。
[0076]植入7天后，微球支架(MSS)显示出横跨支架整个深度的显著且均匀的细胞侵袭 (图1C)。相对地，细胞零星且仅部分侵入0.3%对照支架（图1B)，并且未能侵入1%对照支 架，而是沿着所述支架的外围增殖(图1A)。
[0077]植入14天后，MSS显示出横跨支架深度的强劲的细胞侵袭（图2C)。相对地，细胞零 星侵入〇.3%(w/v)胶原支架（图2B)，并且完全未能侵入l%(w/v)胶原支架，而是仅保持局 限于外围（图2A)。
[0078] 实施例3.相对于水凝胶密度不同的微球密度促进细胞浸润。
[0079] 如下制备在微球(MS)和水凝胶(H)中具有不同胶原密度(w/v)的微球支架：（A)在 0.3%!1中1%胶原15;(8)0.6%]\^/0.3%!1 ;(〇0.4%]\^/0.2%!1;(0)0.4%]\^/0.6%!1。参见 表1。
[0080] 表1.微球支架的密度
[0082]将MSS皮下植入成年小鼠的背部，并在植入后7天和14天时收获用于免疫组织化 学。免疫组织化学分析确认在所有MSS中的细胞浸润（图3A-3D)，在1 %MS/0.3 % Η和0.6 %MS 0.3%H中观测到最大浸润（图3C-3D)。此外，植入7天和14天后在所有MSS中观测到⑶31表达 (图4A-4B)，表示侵入的内皮前体细胞和新生血管形成。
[0083] 实施例4 .MSS经28天植入促进细胞浸润。
[0084] 18只小鼠的每只小鼠如下接受4种皮下植入物(A-D): (A)MSS(在0.3%胶原本体中 1%胶原微球本体胶原水凝胶对照，（C)0.3%胶原水凝胶对照，和(D)INTEGRA真皮 再生模板（Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)的7mm直径切片。在植入后第7、14和28 天时处死小鼠（每个时间点6只小鼠）。
[0085] 植入后7天时（图5A-5D)，MSS、1 %胶原对照和INTEGRA支架相对于植入前保留相似 尺寸和形态，而0.3%胶原对照的尺寸显著减小（图。植入后1周时MSS的H&E染色显示细 胞一路侵入支架的中心（图6A)。相比之下，除了沿着材料已裂开的裂缝外，1%胶原支架无 侵袭（图6B)。收缩的0.3%胶原支架中也具有最小侵袭（图6C)。用CD31抗体（以确认内皮祖 细胞)和DAPI(以确认浸润细胞)对MSS模板进行荧光染色显示，多种细胞类型（包括内皮祖 细胞)在7天时已经浸润MSS支架（图7)。在1 %和0.3 %水凝胶对照中未观测到⑶31+细胞(数 据未示出）。
[0086] 14天后（图8A-8E)，MSS、1 %胶原对照和INTEGRA支架仍然接近植入前尺寸，而 0.3%胶原对照的尺寸显著减小（图SEhMSS支架显示出显著的细胞侵袭（图9A);除了沿着 裂纹外，1 %胶原显示出最小侵袭（图9B);且0.3 %胶原支架显示出零星侵袭（图9C)。 INTEGRA支架相比于MSS支架显示出不那么强劲的侵袭（图9D); INTEGRA支架的致密结构在 为了 H&E染色的切片过程中导致支架剪切。
[0087] 每单位支架面积的细胞计数的比较（图10)显示在7天和14天时，相对于1%水凝胶 (每单位面积约3个和5个细胞)和0.3%水凝胶(每单位面积约3个和7个细胞），显著更多的 细胞侵袭MSS支架(每单位面积分别约7个细胞和10个细胞）。
[0088] 植入后28天时（图11六-110)肩33、1%胶原对照和11^^61^支架相比植入前尺寸略 微更小，而0.3 %胶原对照比在7天或14天时更小（图1 ID) JSS支架在第28天时显示出良好 的细胞侵袭（图12A)，1%胶原显示出实质上无侵袭（图12B)，且0.3%胶原支架尽管其尺寸 小，但显示出侵袭（图12C)。INTEGRA支架也显示出一些侵袭（图12D)。
[0089]实施例5.微球的扫描电子显微镜。
[0090] 如实施例1中那样制备微球并准备用于扫描电子显微镜(SEM)。如图13中所见，微 球的尺寸(介于50_300μπι之间）和形状(一些为高度球形的，而其它的形态为不规则的）可不 同。
【主权项】
1. 一种组织支架材料，其包含水凝胶和微球，所述水凝胶包含第一聚合物且所述微球 包含第二聚合物，其中所述微球嵌埋在所述水凝胶中，且所述微球具有大于所述水凝胶的 密度。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二聚合物独立地选自由以下构成的 组:胶原、明胶、弹性蛋白、透明质酸盐、纤维素、纤维蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、 聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己内酯）、聚(琥珀酸丁二酯）、聚(三亚甲基碳酸酯）、 聚(对二氧环己酮)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[对苯二酸双(羟乙基)酯-正磷酸乙酯/对苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙 烯酸烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_羟基链烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第二聚合物是胶原。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第一聚合物是胶原。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球包含0.2%至2.0% w/V的所述第二聚合物。6. 根据权利要求5所述的组织支架材料，其中所述微球包含0.4%至1.2%w/v的所述第 二聚合物。7. 根据权利要求6所述的组织支架材料，其中所述微球包含0.6%至1.0%w/v的所述第 二聚合物。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球的直径介于50-250μ m之间。9. 根据权利要求4-8中任一项所述的组织支架材料，其中所述水凝胶包含0.1 %至 0.6 % w/v的量的胶原。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球占组织支架材料的 体积的至少约70%。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球包含0.4至1.2% w/v的胶原，且所述水凝胶包含0.2至0.6 % w/v的胶原。12. 根据权利要求11所述的组织支架材料，其中所述微球包含0.6-1.0%w/v的胶原，且 所述水凝胶包含〇. 3 % w/v的胶原。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球进一步包含生物 活性因子。14. 根据权利要求1-12中任一项所述的组织支架材料，其中所述微球不包含附加的生 物活性因子。15. 根据权利要求1-14中任一项所述的组织支架材料，其为片材形式或为可流动形式。16. 根据权利要求15所述的组织支架材料，其中所述材料为厚度为0.5-3.Omm的片材形 式。17. 根据权利要求16所述的组织支架材料，其中所述材料为厚度为约1.0-2. Omm的片材 形式。18. 根据权利要求1-17中任一项所述的组织支架材料在受试者的伤口愈合或组织再生 方法中的用途。19. 一种在有需求的受试者中促进伤口愈合或组织再生的方法，其包括将权利要求1- 17中任一项所述的组织支架材料施用至所述受试者的伤口或组织。20. 根据权利要求19所述的方法，其中将所述组织支架材料施用至所述受试者的具有 外露骨、硬件或坏死组织的区域。21. -种制造组织支架材料的方法，其包括以下步骤： a. 提供包含微球的第一组合物和包含聚合物材料的第二组合物，所述第一组合物具有 与所述第二组合物不同的密度； b. 混合所述第一和第二组合物;和 c. 使所述聚合物材料在所述混合物中交联，以形成具有嵌埋微球的水凝胶。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述第一和第二组合物各自包含胶原作为聚合 物。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述胶原是人胶原或牛胶原。24. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述胶原是经中和的。25. 根据权利要求21 -24中任一项所述的方法，其中所述微球包含0.4 %至1.2 % w/v的 胶原。26. 根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述第二组合物包含0.1 %至0.6 % w/v的胶原。27. 根据权利要求21 -26中任一项所述的方法，其中所述微球包含0.6-1.0 % w/v的胶 原，且所述第二组合物包含0.3 % w/v的胶原。28. 根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中所述交联通过热方法完成。29. -种通过权利要求21-28中任一项所述的方法制得的组织支架材料。30. -种敷料，其包含权利要求1-17或29中任一项所述的组织支架材料。
【文档编号】A61L27/52GK105916528SQ201480073519
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年11月19日
【发明人】J·斯佩克特, A·D·斯托克, J·摩根
【申请人】康奈尔大学