Rsv特异性抗体及其功能部分的制作方法

Rsv特异性抗体及其功能部分的制作方法
【专利摘要】本申请提供了能够特异性地结合RSV的抗体及其功能等效物，连同用于生产它们的手段和方法。
【专利说明】RSV特异性抗体及其功能部分 继续申请资料
[0001] 本申请要求于2014年1月15日提交的美国临时申请序列号61/927,819的权益，将 其通过引用结合在此。 说明书 领域
[0002] 本申请涉及生物技术和医药领域。 背景
[0003] 呼吸道合胞病毒(RSV)是属于副粘病毒科的普通感冒病毒。RSV是具剧毒的，易传 播，并且在小于2岁龄的儿童中是下呼吸道疾病的最常见病因。在单个RSV季节，高达98%的 参加日托的儿童会被感染。感染有RSV的0.5%和3.2 %之间的儿童需要住院。在美国每年报 道大约有90,000例入院以及4,500例死亡。归因于RSV而住院的主要风险因素是早产、慢性 肺病、先天性心脏病、免疫功能受损、以及在其他健康儿童中年龄小于6周。除以充足营养形 式进行的支持性护理和氧疗外，还需要另外的针对RSV阳性细支气管炎的治疗。抗病毒疗法 例如利巴韦林未被证明在RSV感染中有效。一种单克隆抗体帕利珠单抗(又称Synagis，被 登记用于针对RSV感染的预防。帕利珠单抗是针对RSV融合蛋白的基因工程化的(人源化的） 单克隆抗体。虽然帕利珠单抗已经成为非常有效的预防药，提供针对RSV的另外的覆盖度的 替代性抗体和疗法将是有利的。
[0004] 本发明的目的是提供用于消除和/或预防RSV感染的手段和方法。本发明的又一目 的是提供针对RSV的替代性和/或改进抗体或此类抗体的功能等效物，以及提供能够产生针 对RSV的抗体或其功能等效物的稳定细胞。 概述
[0005] 根据本说明书，能够特异性地结合呼吸道合胞病毒的合成的、重组的或分离的抗 体或其功能部分包括： a. 重链可变区CDR1序列，其包括与序列NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)至 少70%-致的序列，以及 b. 重链可变区CDR2序列，其包括与序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)至少75%-致的序列，以及 c. 重链可变区CDR3序列，其包括与序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)至少70%-致的序列，以及 d. 轻链可变区CDR1序列，其包括与序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少85% -致的序 列，以及 e. 轻链可变区CDR2序列，其包括与序列VASNLET(SEQ ID N0:5)至少70%-致的序列， 以及 f. 轻链可变区⑶R3序列，其包括与序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)至少70%-致的序列。 并且其中在重链中至少一个氨基酸不同于SEQ ID N0:7,并且所述至少一个氨基酸选 自：
[0006] 在另一个实施例中，该抗体或功能部分包括：
a. 重链可变区CDR1序列，其包括与NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一 个氨基酸的序列， b. 重链可变区CDR2序列，其包括与GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一个或两个氨基酸的序列， c ·重链可变区CDR3序列，其包括与ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)相差一个或两个氨基酸的序列， d. 轻链可变区CDR1序列，其包括与QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一个氨基酸的序 列， e. 轻链可变区⑶R2序列，其包括与VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一个氨基酸的序列，和/ 或 f. 轻链可变区⑶R3序列，其包括与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列。
[0007] 在另一个实施例中，该抗体或功能部分包括 a. 重链可变区CDR1 序列，其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)， b. 重链可变区 CDR2 序列，其包括 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO:10), c ·重链可变区 CDR3 序列，其包括 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID NO:11), d. 轻链可变区CDR1序列，其包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)， e. 轻链可变区CDR2序列，其包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 轻链可变区CDR3序列，其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0008] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0010] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0011] 在另外的实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0013] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0014] 在另外的实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
[0015] 在另外的实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0017]在另外的实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0018] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0019] 在另外的实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO:7的氨基酸：
[0020] 在又一个实施例中，该重链可变区⑶R1序列包括与NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN (SEQ ID勵:9)相差一个氨基酸的序列，该重链可变区〇)1?2序列包括与611?￥1^17!^4?1^06 (SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID勵：10)相差一个或两个氨基酸的序列，和/ 或该重链可变区CDR3序列包括与ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID NO: 3)或ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11)相差一个或两个氨基酸的序列。
[0021] 在又一个实施例中，该轻链可变区CDR1序列包括与QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相 差一个氨基酸的序列，该轻链可变区⑶R2序列包括与VASNLET(SEQ ID NO:5)相差一个氨基 酸的序列，和/或该轻链可变区⑶R3包括与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列。
[0022] 在又一个实施例中，该重链可变区⑶R1序列包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN (SEQIDN0:9)，该重链可变区CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)，和/或该重链可变区CDR3序列包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。
[0023] 在另外的实施例中，该轻链可变区CDR1序列包括QASQDIVNYLN(SEQIDN0:4)，该 轻链可变区CDR2序列包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，和/或该轻链可变区CDR3序列包括 QQYDNLP(SEQ ID N0:6)〇
[0024] 在一个实施例中，能够特异性地结合至RSV F抗原的合成的、重组的或分离的抗体 或其功能部分包括 a. 重链可变区CDR1序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0:9)，以及 b. 重链可变区CDR2序列，其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)，以及 c. 重链可变区CDR3序列，其包括氨基酸序列ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)，以及 d. 轻链可变区CDR1序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，以及 e. 轻链可变区⑶R2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 轻链可变区CDR3,其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0025] 在另一个实施例中，能够特异性地结合至RSV F抗原的合成的、重组的或分离的抗 体或其功能部分包括： a. 重链可变区CDR1序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0:9)，以及 b. 重链可变区CDR2序列，其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)，以及 c. 重链可变区CDR3序列，其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)，以及 d. 轻链可变区CDR1序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，以及 e. 轻链可变区⑶R2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，以及 f. 轻链可变区CDR3,其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)。
[0026] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分具有在位置252Y具有Y、在位置254T具有T 并且在位置256具有Ε的Fc区域，其中编号对应于卡巴特(Kabat)的EU索引。
[0027] 在仍又一个实施例中，抑制受试者体内的RSV感染的方法包括向该受试者给予在 此描述的抗体或功能部分。
[0028] 在仍又一个实施例中，合成的、重组的或分离的核酸序列编码在此描述的抗体或 功能部分。
[0029] 将在之后的说明书中部分地阐述另外的目的和优点，并且从说明书中部分是显而 易见的，或者通过实践可以获知。这些目的和优点将通过在所附权利要求中具体指出的要 素和组合来实现和获得。
[0030] 应当理解的是，前面的一般描述和下面的详细描述仅仅是示范性的和说明性的， 并且不限制权利要求书。
[0031] 附图（它们被结合在本说明书中并且构成了本说明书的一部分)展示了一个(若干 个)实施例并且与本说明书一起用来解释在此描述的原理。 附图简要说明
[0032]图1A和B是D25重链和若干重链变体(J、L和LA)的序列的表示。
[0033]图2是若干优化变体(167、1?5、2010)的重链的序列的表示。
[0034]图3A和B是优化变体1G7的四种另外的变体的重链的序列的表示。通过掺入种系残 基制备这些变体（1G7-GLM、B12-1、E3-5和E9-2)以改变pi。
[0035]图4A和B示出了 D25和若干变体在微量中和测定中的体外活性。
[0036] 图5A和B显示，D25和若干变体提供了针对RSV A2和RSV B亚型攻击的保护。
[0037]图6示出了在用1G7、1F5、D25(在图中被命名为D25wt)或无抗体处理的动物中棉鼠 RSV A2攻击的结果。
[0038] 图7A和B显示，1G7针对RSV A2和RSV B9320二者提供保护。将RSV的肺滴度标绘为 在收获时人类IgG的血清浓度的函数。
[0039] 图8A和B示出了通过各种抗体中和RSV A2和RSV B9320二者。
[0040] 图9A和B示出了用于结合1G7的表位，如通过单克隆抗体抗性突变体所定义的。 [0041 ]图10示出了针对RSV的临床分离株的中和测定的结果。 序列说明
[0042 ]表1提供了本发明实施例中提及的某些序列的列表。
实施例说明 I.抗体或其功能部分
[0043]提供了与其他抗体相比具有改进的特性的改进RSV特异性抗体或其功能部分。抗 体或功能部分，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单 克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab '和F (ab'）2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH±或的片 段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5， 892,019之中。本披露涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例 如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、类别（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2)或 子类。
[0044]例如，诸位发明人成功产生了超过之前的RSV特异性抗体的具有改进特性的RSV特 异性抗体，这些改进特性包括针对RSV A亚型和RSV B亚型改进的保护，改进的中和以及降 低的IC50值。此类抗体对RSV具有特别高或强的亲和力，并且因此特别适于消除和/或至少 部分地预防RSV感染和/或RSV感染的不良反应。抗体及其功能部分与RSV特异性结合分子同 义，并且包括能够特异性地结合RSV的任何全长抗体或抗体部分。 A.非种系残基变为种系残基的抗体或功能部分 [0045] 在一个实施例中，将D25的重链可变区（SEQ ID N0:7)的至少一个非种系残基变为 种系残基。在另一个实施例中，将D25残基的重链可变区的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12个非种系残基转换回种系残基。在又一个实施例中，可以将至少一种非种系残基变为种 系残基，并且相对于SEQ ID N0:7,可以修饰至少一个⑶R位置。
[0046] -个实施例包括分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地结 合呼吸道合胞病毒并且包括： a) 重链CDR1序列，其包括与序列NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)至少 70%、75%、80%、85%、90%或94%-致的序列， b) 重链 CDR2 序列，其包括与序列 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或 GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO: 10)至少70%、75%、80%、85%、90%或94% -致的序列， c) 重链 CDR3 序列，其包括与序列 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或 ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID NO: 11)至少70%、75%、80%、85%、90%或94% -致的序列， d) 轻链CDR1 序列，其包括与序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少70%、75%、80%、 85%、90 %或94 %-致的序列， e) 轻链CDR2序列，其包括与序列VASNLET(SEQ ID N0:5)至少70%、75%、80%、85%、 90%或94%-致的序列，以及 f) 轻链CDR3序列，其包括与序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6)至少70%、75%、80%、85%、 90 %或94 %-致的序列。 并且其中在重链中至少一个氨基酸不同于SEQ ID N0:7,并且所述至少一个氨基酸选 自：
[0047] "重链可变区中至少一个氨基酸不同于SEQ ID N0:7"意指该抗体或功能部分必须 包括来自SEQ ID N0:7的至少一个氨基酸差异，但是在一些实施例中，它可以包括来自SEQ ID N0:7的不止一个差异。在一些实施例中，它包括表2中所述的取代，在表2中列出的位置 处的缺失或替代性氨基酸，或没有在表2中列出的位置中的差异(包括缺失、取代或添加）。 在表2中提供了相对于SEQ ID N0:7的位置编号，并且该位置编号最终可能不与基于感兴趣 的抗体或功能部分中氨基酸的连续编号的位置编号相同。相反，基于与SEQ ID N0:7的比 对，指定位置编号。
[0048] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链和/或轻链，其中该重链可变区与 SEQIDN0:7或SEQIDN0:15至少90%-致，并且其中该轻链可变区与SEQIDN0:8至少 90%-致。在另一个实施例中，该重链可变区与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:15至少91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%-致。在另一个实施例中，该轻链可变区与 SEQ ID N0:8至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%-致。
[0049] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区⑶R1序列，其包括与NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一个氨基酸的序列。
[0050] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区CDR2序列，其包括与 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一个或两个 氨基酸的序列。
[0051] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区CDR3序列，其包括与 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQIDN0:3)或ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQIDN0:11)相差一个或两个 氨基酸的序列。
[0052]在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区CDR1序列，其包括与 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一个氨基酸的序列。
[0053] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区⑶R2序列，其包括与VASNLET (SEQ ID N0:5)相差一个氨基酸的序列。
[0054] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区⑶R3,其包括与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列。
[0055]在又一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区⑶R1序列（其包括与NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)相差一个氨基酸的序列）、重链可变区CDR2序列（其 包括与GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQIDN0:10)相差一个 或两个氨基酸的序列）、重链可变区CDR3序列（其包括与ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3) 或ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID勵：11)相差一个或两个氨基酸的序列）、轻链可变区0?1序 列（其包括与QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一个氨基酸的序列）、轻链可变区CDR2序列 (其包括与VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一个氨基酸的序列）和/或轻链可变区⑶R3序列（其 包括与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列）。
[0056]在一些实施例中，该抗体或功能部分包括至少一个或多达所有与SEQ ID N0:7(重 链)和/或SEQ ID N0:8(轻链)一致的CDR。
[0057] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区⑶R1序列，其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)。
[0058] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区CDR2序列，其包括 GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)。
[0059] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区CDR3序列，其包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。
[0060] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区⑶R1序列（其包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9))，重链可变区CDR2序列（其包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID觀：10))，和/或重链可变区〇?3序列（其包括 ETALWSTTYLPHYFDN(SEQ ID N0:3)或ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11))。
[0061] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区CDR1序列，其包括 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)〇
[0062] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区⑶R2序列，其包括VASNLET (SEQ ID NO:5)〇
[0063] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区⑶R3,其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6)〇
[0064] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区CDR1序列（其包括 QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))，轻链可变区CDR2序列（其包括VASNLET(SEQ ID N0:5))，和/ 或轻链可变区CDR3(其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0065] 在又一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区⑶R1序列（其包括NYIIN (SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID 勵:9))、重链可变区〇?2序列（其包括611?￥1^17!^4?肝06 (SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID 觀：10))、重链可变区〇?3序列（其包括 ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQIDN0:3)或ETALVVSTTYRPHYroN(SEQIDN0:ll))、轻链可变区 CDR1序列（其包括QASQDIVNYLN( SEQ ID NO: 4))、轻链可变区CDR2序列（其包括VASNLET (SEQ ID N0:5))和/或轻链可变区CDR3序列（其包括QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0066] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区，其包括在框架区内与选自 SEQ ID N0:12-21的序列95%-致的序列。
[0067] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区，其包括在框架区内与选自 SEQ ID N0:12-21的序列一致的序列。
[0068] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO: 7的氨基酸：
在另一个实施例中，表3中提供的差异是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在一个实施例中， 表3中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0069] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表4中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表4中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0070] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表5中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表5中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0072] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表6中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表6中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0073] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表7中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表7中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0074] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表8中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表8中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0075] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸。
在另一个实施例中，表9中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例中， 表9中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区包括 SEQ ID N0:8。
[0077] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表10中提供的差异是与SEQ ID NO:7仅有的差异。在一个实施例 中，表10中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区 包括SEQ ID N0:8。
[0078] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表11中提供的差异是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在一个实施例 中，表11中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区 包括SEQ ID N0:8。
[0079] 在一个实施例中，该抗体或功能部分在重链可变区中包括至少以下不同于SEQ ID NO :7的氨基酸：
在另一个实施例中，表12中提供的差异是与SEQ ID NO: 7仅有的差异。在一个实施例 中，表12中提供的差异不是与SEQ ID N0:7仅有的差异。在另一个实施例中，该轻链可变区 包括SEQ ID N0:8。
[0080] 在一个实施例中，该抗体或功能部分包括重链可变区序列，其包括与SEQ ID NO: 12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20或SEQ ID N0:21 的序列至少70%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%-致的序列。在另一个实施例中，该抗体或功能部分包 括重链序列可变区，其包括与SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20或SEQ ID NO: 21 的框架（即，非CDR)序列至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 一致的序列。
[0081] 在另一个实施例中，该抗体或功能部分包括轻链可变区序列，其包括与序列 DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISS LQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV(SEQIDN0:8)至少70%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99% 或 100%-致的序列。
[0082] 在其他实施例中，应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代涉及一个氨基酸被 另一个具有大体相似特性(大小、疏水性等）的氨基酸取代，这样使得整体功能可能不会受 到严重影响。 B.具有改进的CDR的抗体或功能部分
[0083] 在一个实施例中，相对于存在于SEQ ID N0:7中的⑶R，该抗体或功能部分可以包 括至少一个CDR突变。在一个实施例中，该抗体或功能部分可以包括表13中变化的至少一 种。在另一个实施例中，该抗体或功能部分可以包括表13中变化的一种、两种或所有三种。
[0084] 另一个实施例包括分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地 结合至RSV F抗原并且包括重链可变区⑶R1序列（其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID N0: 9))、重链可变区CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO: 2))、重链可 变区CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO: 3))、轻链可变区CDR1序 列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))、轻链可变区CDR2序列（其包括氨基酸 序列VASNLET(SEQ ID N0:5))以及轻链可变区CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6))〇
[0085] 另一个实施例包括分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地 结合至RSV F抗原并且包括重链可变区⑶R1序列（其包括氨基酸序列NYIIN(SEQ ID N0: 1))、重链可变区CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID NO: 10))、重链 可变区CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO: 3))、轻链可变区CDR1 序列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4))、 轻链可变区⑶R2序列（其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5))以及轻链可变区 CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQ ID N0:6))。
[0086] 另一个实施例包括分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地 结合至RSV F抗原并且包括重链可变区⑶R1序列（其包括氨基酸序列NYIIN(SEQ ID N0: 1))、重链可变区CDR2序列（其包括氨基酸序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO: 2))、重链可 变区CDR3序列（其包括氨基酸序列ETALVVSTTYRPHYFDN(SEQ ID如：11))、轻链可变区0?1 序列（其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID勵:4))、轻链可变区0?2序列（其包括氨基 酸序列VASNLET(SEQIDN0:5))以及轻链可变区CDR3(其包括氨基酸序列QQYDNLP(SEQID N0:6))〇
[0087] 在另一个实施例中，分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分包括重链可变区 (其包括重链⑶Rl、CDR2和⑶R3)以及轻链(其包括轻链⑶Rl、CDR2和⑶R3)，其中重链⑶R中 的至少一种、两种或所有三种选自表14中的列A，剩余的重链CDR(如果有的话)选自表14中 的列B，并且轻链CDR包括表14中的列C。因此，在一个实施例中，在表14的列C中提供了轻链 ⑶R，并且只要重链具有各⑶R1、⑶R2和⑶R3之一，重链⑶R便可以从列A和B混合和匹配。
[0088] 各个替代性CDR实施例不一定包含以上在部分I.A中讨论的任何非种系至种系突 变，但是任何或所有那些突变可任选存在。
[0089] 在一个实施例中，该抗体或功能部分可以包括来自表14的替代性重链⑶R中的至 少一种，并且可以具有至少一种其他CDR修饰。确切地，在又另一个实施例中，该抗体或功能 部分可以包括重链⑶R1序列（其包括与NYIIN(SEQ ID N0:1)相差一个氨基酸的序列）、重链 CDR2序列（其包括与GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQIDN0:2)相差一个或两个氨基酸的序列）、重 链CDR3序列(其包括与ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID N0:3)相差一个或两个氨基酸的序列）、 轻链CDR1序列（其包括与QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一个氨基酸的序列）、轻链CDR2序 列（其包括与VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一个氨基酸的序列）和/或轻链⑶R3序列（其包括 与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列），其中重链CDR1中的至少一种是DYIIN (SEQ ID N0:9)，重链CDR2是GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID 腸：10)，或重链001?3是 ETALWSTTYRPHYFDN(SEQ ID N0:11)。 C. 具有改进的半衰期的抗体或功能部分
[0090] 在一个实施例中，可以对在此描述的抗体或功能部分进行另外的修饰以改进其半 衰期。在一个实施例中，可以对抗体或功能部分进行突变如缺失、添加或取代突变以改进其 半衰期。在一个实施例中，可以将Fc区域突变为包括以下取代M252Y、S254T以及T256E中的 一种、两种或所有三种，其中编号对应于卡巴特的EU索引。在一个实施例中，可以将Fc区域 突变为包括所有以下取代M252Y、S254T以及T256E，其中编号对应于卡巴特的EU索引。戴尔' 阿夸(Dall'Acqua)等人，针对提高的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合工程化的人类IgGl的特 性（Properties of Human IgGls Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor(FcRn))，生物化学杂志（J Biol Chem)281(33): 23514-23524(2006)。具有所 有三种取代的实施例被表示为YTE变体。换言之，在一个实施例中，该抗体或功能部分具有 在位置252Y具有Y、在位置254T具有T并且在位置256具有E的Fc区域，其中编号对应于卡巴 特的EU索引。 D. 抗体及其功能部分的其他特征
[0091]在某些实施例中，该抗体或功能部分在体外中和测定中具有小于lOng/ml的IC50 值，其中将HEp-2细胞用RSV和抗体或功能部分进行感染。在另一个实施例中，针对RSV亚型A 和/或RSV亚型B，IC50是9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml或2ng/ml 或更小。在一个实施例中，IC50是在实例中描述的体外中和测定中进行测量的，任选地针对 RSV A2和/或RSV B9320。
[0092]在一个实施例中，抗体及其功能部分对中和RSV亚型A株是有效的。在一个实施例 中，抗体及其功能部分对中和RSV亚型B株是有效的。在另一个实施例中，抗体及其功能部分 对中和RSV亚型A和B株二者是有效的。
[0093] 如在此所使用，术语抗体或其功能部分是以最广泛的意义使用的。其可以为人造 的，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mAb)和/或其功能片段。它既可以 包括完整的免疫球蛋白分子，例如，多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、单特异性抗体、双特异 性抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、动物抗体(例如，骆驼抗体）、嵌合抗体，又可 以包括其部分、片段、区域、肽及衍生物（由任何已知的技术产生，例如但不限于，酶促裂解、 肽合成或重组技术），像例如，缺乏轻链的免疫球蛋白、？813、？313'、？(313'）2、？￥、8〇?￥、抗体片 段、双抗体、Fd、CDR区域或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分或肽序列。在一个实施例 中，该功能部分是单链抗体、单链可变区片段(scFv)、Fab片段或F(ab'） 2片段。
[0094] 如果抗体或功能部分能够特异性地与分子反应从而将该分子与该抗体结合，那么 将其称为"能够结合"该分子。抗体片段或部分可以缺少完整抗体的Fc片段，从循环中更快 速清除，并且可以比完整抗体具有更少的非特异性组织结合。抗体的实例可以使用本领域 中熟知的方法从完整抗体产生，例如，通过用酶(如木瓜蛋白酶（以产生Fab片段)或胃蛋白 酶（以产生F(ab'） 2片段））的蛋白水解裂解。抗体的部分可以通过任何以上方法进行制备， 或者可以通过表达重组分子的一部分进行制备。例如，可以将重组抗体的一个或多个CDR区 域进行分离并亚克隆进适当的表达载体中。
[0095] 在一个实施例中，抗体或功能部分是人类抗体。将人类抗体用于人类疗法可以减 少由在人类个体中针对非人类序列的免疫反应造成的副作用的可能性。在另一个实施例 中，该抗体或功能部分是人源化的。在另一个实施例中，抗体或功能部分是嵌合抗体。以此 方式，感兴趣的序列(像例如感兴趣的结合位点)可以被包括在抗体或功能部分中。
[0096] 在一个实施例中，该抗体可以具有IgG、IgA、IgM或IgE同种型。在一个实施例中，该 抗体是IgG。 II. 编码抗体及其功能部分的核酸
[0097] 本发明实施例进一步提供了分离的、合成的或重组的核酸序列，其编码以上部分 I. A或I .B中描述的任何抗体或功能部分。例如，将此类核酸从B细胞中分离，该B细胞能够产 生抗体或功能部分。此类核酸编码在此列出的重链和轻链序列。可替代地，此类核酸编码重 链和轻链序列，这些重链和轻链序列分别包括在此列出的重链和轻链CDR。在一些实施例 中，这些核酸将编码在此描述的抗体的功能部分。由于核酸密码的简并性，多种核酸将编码 相同氨基酸并且所有都涵盖于此。 III. 使用方法 A.抗体或功能部分的使用方法
[0098] 在一个实施例中，可以将抗体或功能部分用于治疗方法中或用作药物。该方法可 以用于消除或至少部分地预防RSV感染或者用于消除或至少部分地预防RSV感染的不良反 应。该方法还包括向对其需要的个体给予治疗有效量的如在此描述的抗体或功能部分。在 一个实施例中，对其需要的个体是人类患者。
[0099] 在一个实施例中，为了消除RSV，可以在RSV感染发生前向个体给予抗体或功能部 分，换言之作为预防剂。可替代地，当个体已经被RSV感染时，可以给予抗体或功能部分。可 以将所述抗体或功能部分给予具有增加的RSV感染风险的个体，像例如早产儿童，患有慢性 肺病、先天性心脏病和/或免疫功能受损的个体，小于6周龄的儿童。早产儿童包括处于其生 命的第一年的婴儿，连同处于其生命的第二年的儿童以及年龄较大仍处于RSV感染风险的 儿童。老年人也具有增加的RSV感染风险，并且因此可以基于风险有针对性的进行给予。还 可以向有事先RSV感染的个体给予抗体或功能部分。
[0100] 用于治疗性应用，典型地将抗体或功能部分与药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂 和/或赋形剂结合。在一个实施例中，将抗体或功能部分与注射用水结合。在另一个实施例 中，他们在具有组氨酸、甘氨酸以及氯化物的无菌无防腐剂的液态溶液中进行制备。例如， 在另一个实施例中，适合的载体的实例包括钥孔戚血蓝蛋白（KLH)、血清白蛋白（例如，BSA 或RSA)以及卵清蛋白。在另一个实施例中，所述适合的载体包括溶液，像例如，盐水。在其他 实施例中，将抗体或功能部分以冻干形式提供，并且在给予之前与注射用水进行混合。 B.编码抗体或功能部分的核酸的使用方法
[0101] 在又另一个实施例中，可以给予编码抗体或功能部分的核酸。在给予这样的核酸 后，抗体或功能部分通过宿主机器产生。所产生的抗体或功能部分能够预防和/或消除RSV 感染和/或RSV感染的不良反应。
[0102] 编码抗体的功能部分的核酸是指至少30个碱基对长的、至少50个碱基对长的或至 少100个碱基对长的核酸，其包括作为编码抗体的核酸的至少一种表达特征(在种类上未必 在量上）。在一个实施例中，编码抗体的功能部分的核酸至少编码氨基酸序列，该氨基酸序 列包括在此描述的抗体的两种或任选地三种CDR。 IV.制备抗体和功能部分的方法
[0103]还提供了分离的产抗体细胞，其能够产生抗体或功能部分。在此描述的抗体或功 能部分可以从分泌抗体的杂交瘤中生产，或者从重组产生的细胞中生产，该细胞已经用编 码抗体或功能部分的一种或多种基因进行转化或转染。
[0104] -个实施例包括通过在表达核酸以产生抗体的条件下培养宿主细胞，随后回收抗 体来产生抗体或功能部分的方法。多种细胞系可以用来表达抗体或功能部分，包括但不限 于哺乳动物细胞系。在一个实施例中，细胞系可以是人类的。在另一个实施例中，可以使用 细菌或昆虫细胞系。在一个实施例中，细胞系包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、CH0细胞变体 (例如DG44)、293细胞和NS0细胞。在另一个实施例中，细胞系包括VERY、BHK、HelaXOS、 1?0(、293卩、2931'、3了3、￥138、8了483、抱5781\耵82、8了20和了470、0^7030以及抱57888技田胞。
[0105] 重组体表达利用包含多核苷酸的表达载体的构建，该多核苷酸编码抗体或功能部 分。一旦获得了多核苷酸，便可以通过本领域中熟知的重组DNA技术生产用于产生抗体的载 体。表达载体可以包括适当的转录和翻译控制信号。这可以使用体外重组DNA技术、合成技 术和体内基因重组来完成。在一个实施例中，复制型载体包括编码抗体或功能部分的可操 作地连接至异源性启动子的核酸序列。
[0106] 多种宿主表达载体系统可被用以表达抗体或功能部分，如美国专利号5，807,715 中所描述的。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，与载体如来自人巨细胞病毒 的主要立即早期基因启动子元件相结合是抗体的有效表达系统（福金(Foecking)等人，基 因（Gene)，45:101(1986);和科克特（Cocke tt)等人，生物技术（Bio/Techno logy )，8 : 2 (1990))。另外，可选择调节所插入序列的表达、或以所希望的特定方式来修饰并且加工基 因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白 质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰 具有特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保本发明蛋白质的正确 修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化 的细胞机器的真核宿主细胞。
[0107] 在细菌系统中，取决于所表达的抗体或功能部分的预定用途，可以选择许多表达 载体。例如，在产生大量的这种抗体或功能部分以便产生包括抗体或功能部分的药物组合 物时，引导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可以是令人希望的。此类载体包 括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(罗塞（Ruther)等人，欧洲分子生物学学会杂志 (EMB0H2:1791(1983))，其中编码序列可单独地与lac Z编码区同框连接至载体中以使得 产生融合蛋白；pIN载体(井上（Inouye)&井上，1985,核酸研究（Nucleic Acids Res. )13: 3101-3109(1985);凡赫克（Van Heeke)& 舒斯特（Schuster)，1989,生物化学杂志 (J.Biol.Chem. )24:5503-5509(1989))等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽-S-转 移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。总体来说，此类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附并 且结合至谷胱甘肽-琼脂糖亲和基质，随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱来容易地从 溶解的细胞中纯化。PGEX载体被设计成将凝血酶和/或因子Xa蛋白酶裂解位点引入表达的 多肽中以使得克隆的靶基因产物可以从GST部分上释放。
[0108] 在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus ;AcNPV)用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。 蛋白编码序列可单独地克隆进病毒的非必需区（例如，多角体蛋白基因）中并且置于AcNPV 启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
[0109] 在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达 载体的情况下，感兴趣的编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启 动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组 中。插入病毒基因组的非必需区（例如，区E1或E3)中将产生重组病毒，该重组病毒是有生活 力的并且能够在被感染宿主中表达抗体或功能部分（例如，参见，洛根（Logan)和山克 (Shenk)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl .Acad. Sci.USA) ,81:355-359(1984))。特定的起 始信号也可能被要求用于插入的抗体或功能部分编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG 起始密码子和邻近序列。另外，起始密码子通常应当与所希望的编码序列的阅读框同框以 便确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然 的和合成的。表达效率可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高（参见， 例如，特纳（Bittner)等人，酶学方法(Methods in Enzymol ·)，153:51-544( 1987)) 〇
[0110] 稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。例如，可以产生稳定表达蛋白分 子的细胞系。可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位 点等)和选择性标志基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以允许 细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标 记赋予对选择的抗性，并且允许将质粒稳定整合进其染色体中的细胞生长并且形成病灶， 进而可以将其克隆并且扩增成细胞系。编码抗体或功能部分的质粒可以用来将基因 /cDNA 引入适于在培养物中产生的任何细胞系中。
[0111] 可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶（威格勒 (Wigler)等人，细胞(Cell) ,11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(苏帕斯卡 (Szybalska)&撒波斯基(Szybalski)，美国国家科学院院刊(Proc .Natl. Acad. Sci .USA)， 48 :202( 1992))以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（洛伊（Lowy)等人，细胞（Cell) ,22:8-17 (1980))基因可相应地用于tk-、hgprt-或aprT-细胞之中。另外，抗代谢物抗性可以用作选 择以下基因的基础:dhf r，它赋予对甲氨喋呤的抗性(威格勒(Wi g ler)等人，美国国家科学 院院刊(Natl. Acad. Sci.USA) ,77:357(1980);奥黑尔(O'Hare)等人，美国国家科学院院刊， 78:1527(1981)) ;gpt，它赋予对霉酚酸的抗性(穆利根(Mulligan)&贝尔格(Berg)，美国国 家科学院院刊，78:2072( 1981)) ;neo，它赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性(吴(Wu)和吴，生物 疗法（Biotherapy )3:87-95(1991);托斯塔谢夫（Tolstoshev)，药理学与毒理学年鉴 (Ann ·Rev·Pharmacol · Toxicol ·)32: 573-596( 1993);穆利根（Mulligan)，科学（Science) 260:926-9 32(1993);以及摩根（Morgan )&安德森（Anderson)，生物化学年鉴 (Ann.Rev.Biochem. )62:191-217( 1993);梅（May)，TIB TECH 11 (5) :155-215( 1993));以及 hygro,它赋予对潮霉素的抗性(圣德尔（Santerre)等人，基因（Gene)，30:147(1984))。可以 常规地应用在重组DNA技术领域中通常已知的方法来选择所希望的重组克隆，并且此类方 法描述于例如奥苏贝尔(Ausubel)等人(编著），当代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰&威利父子公司（John Wiley&Sons)，纽约（1993);克里格勒 尔（Kriegler)，基因转移和表达：实验手册（Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社（Stockton Press)，纽约（1990);以及德拉柯波利 (Dracopoli)等人（编著），当前人类遗传学方案（Current Protocols in Human Genetics)，约翰&威利父子公司，纽约（1994)的第12和13章；库尔柏利-加拉平(Colberre-Garapin)等人，1981，分子生物学杂志(J.Mol .Biol ·)，150:1。
[0112] 一旦抗体或功能部分已经通过重组表达产生，就可以通过本领域中已知的用于免 疫球蛋白分子的纯化的任何方法将其纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色 谱(特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力）以及尺寸分级柱色谱）、离心、差别溶 解度，或者通过用于蛋白质的纯化的任何其他标准技术。此外，本发明的蛋白质或其片段可 以融合至在此所描述的或者本领域中另外已知的异源多肽序列，以便促进纯化。
[0113] 在一些实施例中，产生产RSV特异性抗体细胞，其稳定至少六个月。在另一个实施 例中，产RSV特异性抗体细胞稳定至少九周、至少三个月或至少六个月。在另一个实施例中， 制备抗体和功能部分的替代性方法在本领域中是熟知的，并且至少描述于美国专利号8， 562,996 中。
[0114] 现在将详细参考本发明示例性实施例，其实例示于附图中。在可能的情况下，在整 个附图中将使用相同的参考号来指示相同或相似的部分。通过考虑在此披露的说明书和实 践，其他实施例对于本领域技术人员将是清楚的。实施例进一步于以下实例中进行解释。这 些实例并不限制权利要求书的范围，而是仅用于阐明某些实施例。说明书和实例的意图仅 被认为是示例性的，真实范围和精神通过以下权利要求书指明。 实例 实例1.单克隆抗体的制备和表达
[0115] 将1G7免疫球蛋白可变轻链(VL)和可变重链(VH)(其各自包含改进抗体效力的所 希望的突变）的DNA片段插入人类IgGl表达载体（其包含κ轻恒定区和CH1-铰链-CH2-CH3IgGl重恒定区）中。为了表达1G7抗体，使用293Fectin?试剂(英杰公司（Invitrogen)，卡 尔斯巴德，加利福尼亚州），将人类胚肾293-F细胞用含1G7的载体进行瞬时转染。使细胞在 37 °C、120rpm下，在5 % %湿度的情况下生长。将培养基在第二天通过添加等体积的 培养基进行补料，并且在转染后10天收获。将上清液进行无菌过滤以去除细胞和碎片。使用 蛋白Α柱(Hi - trap蛋白Α柱，西格马（S i gma))纯化I gG，并且将洗脱的蛋白在4 °C下用PBS透析 过夜。在NanoDrop(赛默科技公司（Thermo Scientific))中通过蛋白定量确定IgG浓度。
[0116] 采取同样的方法来产生其他抗体。 实例2.体外微量中和测定
[0117] 如下进行微量中和测定：简言之，以15μ!7孔的体积，将MAb的2倍连续稀释液引入 384孔微量滴定板的HEp-2细胞培养基中。随后，将15yL的RSV A2或RSV B 9320病毒稀释于 HEp-2细胞培养基中至浓度范围从80至150pfu/孔，并且将其添加至各孔，包括仅包含HEp-2 细胞培养基的对照孔，并且将板在37 °C下在5 %⑶2的情况下孵育1.5小时。将30yL的HEp-2 细胞以2.5x 105个细胞/mL添加至各孔中，并且将这些板在37°C下在5%⑶2的情况下进行 孵育。在3天（针对RSV A2)或4天（针对RSV B9320)后，去除培养基，并且添加30yL冰冷的 80%丙酮/20%PBS以固定这些细胞。
[0118] 使用靶向RSV F的C位点的偶联辣根过氧化物酶的抗-RSV F MAb(1331H)，通过酶 联免疫吸附测定（ELISA)测量病毒复制（比勒（Beeler)和范?怀克寇林格（van Wyke Coelingh)，病毒学杂志(J Virol. )63(7) :2941-2950(1989))。将1331H MAb以1:6,000 稀释 于PBS中，并且将30μ1添加至各孔中。在37°C下孵育两小时之后，将这些板用PBS-T洗涤三 次。将TMB过氧化物酶30yL添加至各孔中，并且将这些板在室温下在黑暗中孵育15分钟。将 反应通过向各孔添加15yL的2N H2S04来停止。使用酶标仪通过监测450nm下的吸光度来测 量底物转化。使用log(抑制剂)对应答与可变斜率曲线拟合，在Graphpad Prism中使用非线 性拟合算法计算IC50值，，并且IC50值表示在450nm下所测量的吸光度减少50%所需要的 MAb浓度。
[0119] 结果提供于图4中，该图显示在微量中和中1G7、1F5、2D10和D25各自抑制了RSV A2 和RSV B9320复制。1G7是最有效的，其次是1F5、2D10，并且然后是D25。 实例3.棉鼠 RSV模型 A)比较D25、J、L和LA变体针对RSV攻击提供保护的能力
[0120] 以图中指示的各个剂量水平，通过肌内注射向动物给药0.1ml的抗体。二十四小时 后，使用异氟烷室对动物进行麻醉，并且通过鼻内滴注lXl〇 6pfu/动物的RSV株A2进行感 染。四天后，通过二氧化碳室息处死动物;将它们的肺经外科手术摘除，切成两份并且在液 氮中冷冻或立即处理。在处死时，通过心脏穿刺获得血液样品。
[0121] 为了评估MAb给予对棉鼠肺中的RSV复制的影响，针对各剂量组确定棉鼠肺匀浆物 中的RSV病毒滴度。出于该目的，在室温下，用TeenALysing基质管，在10份（重量/体积） Hanks平衡盐溶液加蔗糖磷酸酯中，使用快速制备型24组织匀浆器将收获的肺单独匀浆20 秒。将得到的悬浮液以930 X g在4°C下离心10min，并且收集上清液并储存在-80 °C下直至分 析。在接种前24小时，将肺匀浆物样品以1:10和1:100稀释于培养基中，并且将50yL的未稀 释的肺匀浆物或稀释的肺匀浆物样品添加至HEp-2细胞的一式两份孔中，这些HEp-2细胞以 2.5\10 5个细胞/孔的细胞密度被种于24孔板中。在37°(：下，在5%〇)2的情况下孵育1小时 后，将接种物用包含0.8%甲基纤维素的培养基替换，并且将这些细胞在37°C下，在5%⑶ 2 的情况下进行孵育。五天后，去除覆盖物，并且将这些细胞固定并且用山羊抗-RSV多克隆抗 体进行免疫染色，随后用二级抗-山羊HRP抗体进行免疫染色。将噬斑通过与AEC试剂反应来 进行可视化。在显微镜下，使用10 X物镜量化噬斑。本测定的检测极限是200pfu/g组织。出 于统计分析的目的，在l〇〇pfu/g(检测下限的一半)下，指定具有低于检测极限（<200pfu/g) 的病毒滴度的样品。结果提供于图5中，证实在针对RSV A攻击提供保护方面，J、L和LA变体 都比D25更有效，但是L和LA变体在针对RSV B亚型提供保护方面不太有效(其中L针对一种B 株比针对另一种表现要好）。基于该数据，选择J作为用于进一步优化的起点。 B) 比较1G7、1F5和D25变体针对RSV攻击提供保护的能力
[0122] 使用本实例的以上部分(A)中讨论的模型来比较1G7、1F5和D25针对RSV攻击提供 保护的能力。以2mg/kg、lmg/kg、0 · 5mg/kg和0 · 25mg/kg对动物进行给药。结果显示于图6中。 数据显示，1G7在针对RSV攻击提供保护方面比1F5表现要好，尽管两者都能够将病毒滴度降 至检测极限。1G7和1F5二者都比D25表现要好。 C) 1G7变体的详细评价
[0123] 如以上部分(A)中所描述的，使用相同的棉鼠模型。如图7中所报道的，在存在的抗 体的各个浓度下，每只动物都接受0.1ml的抗体。针对RSV A2和RSV B9320二者，1G7证实了 与RSV肺滴度的剂量-应答关系。 D) 比较变体中和RSV A2和RSV B9320的能力
[0124] 如以上部分(A)中所描述的，使用相同的棉鼠模型。
[0125] 使用ELISA方法确定在肺收获当天棉鼠血清样品中的人类IgG浓度。在本测定中， 通过结合至微量滴定板的山羊抗-人类抗体捕获人类抗体。在4 °C下，在30yL体积中，将山羊 抗-人类IgG(H+L)抗体(0.5yg/mL，在1 XPBS中）涂布在Nunc Maxisorp 384孔微量滴定板上 过夜。将板进行洗涤，然后用60此的PBS+3%热灭活的山羊血清的溶液在室温下封闭1小时。 去除封闭缓冲液，并且将样品进行如下应用：将稀释于测定缓冲液中的标准人类抗体的两 倍连续稀释液用于浓度范围为500ng/ml至0.488ng/ml的标准曲线。使用4参数曲线拟合来 拟合标准曲线。
[0126] 结果提供于图8中，该图显示，在此描述的变体在中和RSV A2和RSV B9320两者中 都具有比D25低的IC50。这还证实到，针对A2或B9320病毒不存在活性损失，其中在E9-2和 B12-1的情况下看到增加的活性，并且在1G7GLM和E3-5的情况下针对B9320病毒仅存在名义 活性损失。 实例4.如通过单克隆抗体抗性突变体所定义的表位
[0127] 在250ng/ml的1G7-YTE存在下，将RSV A和RSV B病毒突变体通过传代三次进行分 离。1G7-YTE是具有以上部分I.C中描述的YTE突变的1G7抗体。在最后的传代后，确定RSV F 蛋白的序列。突变对应于在RSV F与亲本D25抗体的共晶体结构中先前定义的区域。所有的 抗性突变体在氨基酸200-213之间的F1区域中都包含RSV F蛋白的区域改变。在位置294处 的二级突变并没有显示提高抗性，并且与在区域200-213中具有单一突变的那些相比并没 有更多的抗性。F2区域中的N208S突变背景的二级突变产生了提高的抗性。结果提供于图9 中。 实例5.针对RSV的临床分离株的中和作用
[0128] 在HEp2细胞感染前，通过用抗体的一系列稀释液预孵育扩增的临床分离株病毒来 进行中和测定。将细胞的感染测量为在细胞表面上F蛋白表达的函数。通过中和曲线的非线 性拟合计算IC50值。如在实例2中的测量病毒复制(体外微量中和测定）。
[0129] 结果提供于图10中。针对在HEp2细胞中中和RSV的A分离株或B分离株，1G7和1F5的 IC50都比D25低。 通过引用结合
[0130] 出于所有目的，在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以 及其中引用的参考文献(如同它们还未曾引用过的程度)通过引用以其全部内容结合在此。 等效物
[0131] 前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践实施例。前述描述和实 例详述了某些实施例，并且描述了诸位发明人所期望的最佳模式。然而，应领会的是，不论 前述事项可以在文中看起来如何详尽，这些实施例可以按多种方式进行实践，并且权利要 求书包括其任何等效物。
【主权项】
1. 一种合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地结合呼吸道合胞病毒并且 包括： a. 重链可变区CDRl序列，其包括与序列NYIIN(沈Q ID N0:1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)至 少70 %-致的序列，W及 b. 重链可变区CDR2序列，其包括与序列GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO:2)或 011口￥11；17狀6?邸96(569 10^:10)至少75%-致的序列，^及 C.重链可变区CDR3序列，其包括与序列ETALVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID NO:3)或 ￡1八1^晋517￥1??狀。0的沈9 10備：11)至少70%-致的序列，^及 d. 轻链可变区CDRl序列，其包括与序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)至少85% -致的序 列，W及 e. 轻链可变区CDR2序列，其包括与序列VASNLET(SEQ ID NO:5)至少70%-致的序列， W及 f. 轻链可变区CDR3序列，其包括与序列QQY面LP(SEQ ID NO:6)至少70%-致的序列； 并且其中在重链中至少一个氨基酸不同于SEQ ID NO:7,并且所述至少一个氨基酸选 白.2. 如权利要求1所述的抗体或功能部分，其中 a.重链可变区CDRl序列包括与NYIIN(SEQ ID NO:l)或DYIIN(沈Q ID NO:9)相差一个 氨基酸的序列， b .重链可变区 CDR2 序列包括与 GI IPVLGTVHYAPKFQG( SEQ ID NO:2)或 011口￥11；17狀6?邸96(569 10^:10)相差一个或两个氨基酸的序列， C .重链可变区 CDR3 序列包括与 ETALVVSTTYLPHYFDN( SEQ ID NO:3)或 ￡1八1^晋517￥1??狀。0的沈9 10備:11)相差一个或两个氨基酸的序列， d. 轻链可变区CDRl序列包括与QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)相差一个氨基酸的序列， e. 轻链可变区CDR2序列包括与VASNLET(SEQ ID NO:5)相差一个氨基酸的序列，和/或 f. 轻链可变区CDR3序列包括与QQY面LP(SEQ ID NO:6)相差一个氨基酸的序列。3. 如权利要求1所述的抗体或功能部分，其中 a. 重链可变区CDRl序列包括NYIIN(SEQ ID N0:1)或DYIIN(SEQ ID N0:9)， b. 重链可变区CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID NO:2)或GIIP化GTVHYGPKFQG (沈Q ID NO: 10)， C.重链可变区CDR3序列包括ETALWSTTYLPHY抑N(SEQ ID NO:3)或ETALVVSTTYRPHY抑N (沈Q ID NO: 11)， d. 轻链可变区CDRl序列包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)， e. 轻链可变区CDR2序列包括VASNLET(SEQ ID N0:5)，并且 f. 轻链可变区CDR3序列包括QQY面LP(SEQ ID N0:6)。4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或功能部分，其中在重链可变区中至少W下氨 iM：而忿末同不QT?n …. 7 .14. 如权利要求1-13中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区与SEQ ID N0:7或沈Q ID NO: 13至少90%-致，并且其中该轻链可变区与沈Q ID N0:8至少90%-致。15. 如权利要求1-2或4-14中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区CDRl序 列包括与NYIIN(沈Q ID NO: 1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)相差一个氨基酸的序列。16. 如权利要求1-2或4-15中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区CDR2序 列包括与611?￥11；17狀4?邸96(569 10側:2)或611?￥11；1^狀6?阳96(569 10側:10)相差一 个或两个氨基酸的序列。17. 如权利要求1-2或4-16中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区CDR3序 列包括与6141^晋51'1'化?狀抑則沈〇10側:3)或6141^￥￥517￥1^^抑則沈〇10側：11)相差一 个或两个氨基酸的序列。18. 如权利要求1 -2或4-17中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区CDRl序 列包括与0459〇1￥爪^^(569 1〇^:4)相差一个氨基酸的序列。19. 如权利要求1-2或4-18中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区CDR2序 列包括与VASNLET(SEQ ID N0:5)相差一个氨基酸的序列。20. 如权利要求1-2或4-19中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区CDR3包 括与QQYDNLP(SEQ ID N0:6)相差一个氨基酸的序列。21. 如权利要求1-2或4-14或16-20中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变 区CDRl序列包括NYIIN(沈Q ID NO: 1)或DYIIN(沈Q ID N0:9)。22. 如权利要求1-2、4-15或17-21中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区 CDR2序列包括GIIPVLGTVHYAPKFQG(SEQ ID N0:2)或GIIPVLGTVHYGPKFQG(SEQ ID N0:10)。23. 如权利要求1-2、4-16或18-22中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区 CDR3序列包括ETALVVSTTYLPHY抑N(沈Q ID N0:3)或ETALVVSTTYRPHY抑N(沈Q ID N0:11)。24. 如权利要求1-2、4-17或19-23中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区 CDRl序列包括QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)。25. 如权利要求1-2、4-18或20-24中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区 CDR2序列包括VASNLET(沈Q ID NO:5)。26. 如权利要求1-2、4-19或21-25中任一项所述的抗体或功能部分，其中该轻链可变区 CDR3包括QQYDNLP(SEQ ID NO:6)。27. 如权利要求1-26中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区包括在框架 区内与选自SEQ ID N0:7和12-21的序列95%-致的序列。28. 如权利要求1-26中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区包括在框架 区内与选自SEQ ID NO: 12-21的序列一致的序列。29. 如权利要求1-26中任一项所述的抗体或功能部分，其中该重链可变区包括与选自 SEQ ID NO: 12-21的序列至少70%-致的序列。30. 如权利要求1-29中任一项所述的抗体或功能部分，具有轻链可变区序列，该轻链可 变区序列包括与SEQ ID NO:8至少70%-致的序列。31. 如权利要求1-29中任一项所述的抗体或功能部分，具有轻链序列可变区，该轻链序 列可变区包括与SEQ ID N0:8-致的序列。32. -种合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地结合至RSV F抗原并且包 括 а. 重链可变区CDRl序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID NO:9)，W及 б. 重链可变区〔032序列，其包括氨基酸序列611?￥11；17狀6?阳96(56〇10側:10)，^及 。.重链可变区〔01?3序列，其包括氨基酸序列6141^晋517￥1??狀。0則56〇10^:11)，^及 d. 轻链可变区CDRl序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，W及 e. 轻链可变区CDR2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，W及 f. 轻链可变区CDR3,其包括氨基酸序列QQY面LP(SEQ ID N0:6)。33. -种合成的或重组的抗体或其功能部分，其能够特异性地结合至RSV F抗原并且包 括： а. 重链可变区CDRl序列，其包括氨基酸序列DYIIN(SEQ ID NO:9)，W及 б. 重链可变区〔032序列，其包括氨基酸序列611?￥11；17狀6?阳96(56〇10側:10)，^及 。.重链可变区〔01?3序列，其包括氨基酸序列6141^晋517￥1?狀。0則56〇10^:3)，^及 d. 轻链可变区CDRl序列，其包括氨基酸序列QASQDIVNYLN(SEQ ID N0:4)，W及 e. 轻链可变区CDR2序列，其包括氨基酸序列VASNLET(SEQ ID N0:5)，W及 f. 轻链可变区CDR3,其包括氨基酸序列QQY面LP(SEQ ID N0:6)。34. 如权利要求1-33中任一项所述的抗体或功能部分，其中该抗体或功能部分是完全 的人类、人源化抗体，或嵌合的。35. 如权利要求1-34中任一项所述的功能部分，其中该功能部分是单链抗体、单链可变 区片段(30。乂）、化6片段或。(曰6'）2片段。36. 如权利要求1-35中任一项所述的抗体或功能部分，其中该抗体或功能部分在RSV A2的中和测定中具有5.化g/ml或更小的IC50。37. 如权利要求1-36中任一项所述的抗体或功能部分，其中该抗体或功能部分在RSV B9320的中和测定中具有3.化g/ml或更小的IC50。38. 如权利要求1-37中任一项所述的抗体或功能部分，其中该抗体或功能部分具有在 位置252Y具有Y、在位置254T具有T并且在位置256具有E的化区域，其中编号对应于卡己特 的抓索引。39. -种抑制受试者体内的RSV感染的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1- 38中任一项所述的抗体或功能部分。40. 如权利要求39所述的方法，其中该受试者是人类患者。41. 如权利要求40所述的方法，其中该受试者是早产的人类患者。42. -种合成的、重组的或分离的核酸序列，其编码如权利要求1-38中任一项所述的抗 体或功能部分。43. -种抑制受试者体内的RSV感染的方法，该方法包括向受试者给予如权利要求42所 述的核酸。44. 一种分离的产抗体细胞，其能够产生如权利要求1-38中任一项所述的抗体或功能 部分。45.根据权利要求44所述的产抗体细胞，其稳定至少九周。
【文档编号】A61K39/42GK105916520SQ201580003410
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】N·厄布兰德, N·凯乐瓦德-勒雷, A·Q·袁, B·里齐特
【申请人】米迪缪尼有限公司