一种基于胶原制备组织工程表皮的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于胶原制备组织工程表皮的方法，采用人表皮干细胞作为种子细胞，以经过牛胎盘I型胶原构建的3D无细胞基质作为支架，利用添加MMPs抑制剂的CELLnTEC培养系统，气液界面分离法构建为一种有活性的全层组织工程表皮。与现有技术相比，本发明本发明利用通过分化培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，有效减少了支架和人工表皮产品的收缩。利用I型牛胶原3D支架结合CELLnTEC培养系统，能够维持表皮干细胞的增殖和分化，不使用成纤维细胞，有效减少了人工表皮产品制备过程中的工作量和操作步骤。
【专利说明】
_种基于胶原制备组织工程表皮的方法
技术领域
[0001]本发明涉及人体组织工程技术，尤其涉及一种基于胶原制备组织工程表皮的方法。【背景技术】
[0002]皮肤是人体与外界环境接触的屏障，对人体起保护、分泌、代谢等作用，还参与免疫反应，维持机体内环境的稳定等。在临床上大面积烧伤和严重创伤患者，由于缺乏可供移植的自体皮肤，患者康复困难，甚至导致死亡。同种异体皮或异种皮移植是目前临床上治疗大面积烧伤患者应用较多的方法，异种皮肤移植会引起严重的免疫排斥反应，这两种皮肤最终都要遭到宿主组织免疫反应的排斥而脱落掉，因此只能作为暂时封闭创面的一种手段。组织工程皮肤技术的发展与应用为修复、维护和改善损伤皮肤组织功能和形态提供了新的途径。通过体外分离培养表皮干细胞，体外诱导分化成皮肤结构，用于大面积烧伤患者迅速覆盖创面，减少患者水分的丢失以及避免发生严重感染，为挽救患者生命以及自体皮肤的生长提供重要条件。
[0003]组织工程皮肤构建的三要素为种子细胞、支架材料和组织构建。
[0004]组织工程表皮的种子细胞来源皮肤表皮结构基底层的表皮干细胞、黑色素细胞等，表皮干细胞在一定的微环境下可被诱导向角化细胞分化。其中，表皮干细胞具有强大的增殖和分化潜能，是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键源泉，且在体外培养时更容易保持表皮细胞表型。
[0005]支架材料是种子细胞黏附、生长、迀移、增殖和分化的载体，是组织工程皮肤的“真皮”部分。人工合成类支架材料降解速率和微结构容易在合成过程控制，因此容易大规模生产，但其最大缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞黏附及特异基因激活。天然生物类材料来源的的组织工程产品支架具有良好的相容性和适宜的降解速度，但其缺点是力学能力差。目前多采用胶原、氨基多糖等，该类材料具有良好的力学性能、低免疫原性及天然胶原三维支架结构，是一种理想的组织工程支架材料。
[0006]组织构建是组织工程的关键技术，在一定的微环境下，将培养的种子细胞与支架材料复合进行组织构建是组织工程表皮产品的关键步骤。体外构建的组织工程皮肤产品在功能上要接近生理皮肤，表皮细胞必须具有含角化的多层细胞结构，才能保证皮肤移植后具有抗感染、抗摩擦、保湿等防护功能。表皮细胞以单纯的浸没式培养只能形成多层结构， 不能正常角化。而采用气-液分离培养的方式进行体外培养，类同于模拟人体在体条件，能够有效构建组织工程皮肤。[〇〇〇7]目前组织工程皮肤已有多种产品，但大多数产品存在着依赖成纤维细胞作为饲养层，操作步骤多，不易质控，不易操作等缺点。而单纯应用生物材料支架存在支架和皮片收缩的问题。经检索，目前以无细胞I型牛胶原作为支架，同时只接种表皮干细胞而不依赖与真皮成纤维细胞的产品还未见报道。陆洪光等发明了一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法(专利申请号200710201677.1)，该方法以表皮干细胞作为种子细胞，以去表皮真皮作为支架材料，将培养的表皮干细胞膜片接种于去表皮真皮上，进行液下液面培养而得组织工程皮肤。该方法存在一些不足，一是采用的支架材料仅通过去表皮处理，没有经过脱细胞处理，会使支架材料中包含较多的细胞成分，用于临床容易导致免疫排斥反应的发生。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基于胶原制备组织工程表皮的方法。
[0009]本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
[0010]本发明采用人表皮干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原构建的3D基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的全层组织工程表皮，具体包括如下步骤:
[0011](1)表皮干细胞的分离和培养:
[0012]取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispasen中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；
[0013](2)1型牛胶原3D支架制备:[〇〇14]准备接种前1天，制备3D牛胶原支架，胶原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液 10ml，lmL 10XDMEM，0.5mL NaH⑶3，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制好后37°C条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH;[〇〇15](3)接种表皮干细胞:[〇〇16]次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70%?80%融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种6 X 105细胞数量于24mm 的嵌套培养皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培养基2ml，下室中添加Cnt-07， CELLnTEC培养基3ml继续培养2天待细胞100 %汇合成片；[〇〇17](4)气液分离培养构建组织工程皮肤:
[0018] 更换添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，的角质细胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基继续培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基0.8mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至 12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。[0〇19] 进一步，步骤(1)中所述的Dispase II的浓度为3.3mg/ml，温度4°C，消化时间为16 小时，步骤(2)中所述的I型牛胶原的浓度为1.5mg/ml;步骤(3)中所述的接种密度为6X 105 细胞数量于24mm培养面积，培养基为Cnt-07，CELLnTEC;步骤(4)中分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基液体培养2天，气液界面培养12天；步骤(4)中培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM;所述的同种皮肤组织源自健康儿童包皮环切术所切除的包皮组织。
[0020]本发明的有益效果在于:
[0021]本发明是一种基于胶原制备组织工程表皮的方法，与现有技术相比，本发明本发明利用通过分化培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，有效减少了支架和人工表皮产品的收缩。利用I型牛胶原3D支架结合CELLnTEC培养系统，能够维持表皮干细胞的增殖和分化，不使用成纤维细胞，有效减少了人工表皮产品制备过程中的工作量和操作步骤。【附图说明】
[0022]图1是本发明的角化细胞的分离培养与特征鉴定图；
[0023]图2是本发明的组织工程皮肤的组织学形态与特征鉴定图；
[0024]图3是本发明的移植后7天和14天的皮肤愈合情况对比图；
[0025]图4是本发明的组织学检测皮肤再角化情况图。【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明作进一步说明:
[0027]本发明采用人表皮干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原构建的3D基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的全层组织工程表皮，具体包括如下步骤: [〇〇28](5)表皮干细胞的分离和培养:[〇〇29]取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispasell中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；
[0030](6)1型牛胶原3D支架制备:[〇〇31]准备接种前1天，制备3D牛胶原支架，胶原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液 10ml，lmL 10XDMEM，0.5mL NaH⑶3，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制好后37°C条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH;[〇〇32](7)接种表皮干细胞:[〇〇33]次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70%?80%融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种6 X 105细胞数量于24mm 的嵌套培养皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培养基2ml，下室中添加Cnt-07， CELLnTEC培养基3ml继续培养2天待细胞100 %汇合成片；[〇〇34](8)气液分离培养构建组织工程皮肤:
[0035] 更换添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，的角质细胞分化Cnt_3D，CELLnTEC培养基继续培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基0.8mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至 12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。[0〇36] 进一步，步骤(1)中所述的Dispase II的浓度为3.3mg/ml，温度4°C，消化时间为16 小时，步骤(2)中所述的I型牛胶原的浓度为1.5mg/ml;步骤(3)中所述的接种密度为6X 105 细胞数量于24mm培养面积，培养基为Cnt-07，CELLnTEC;步骤(4)中分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基液体培养2天，气液界面培养12天；步骤(4)中培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM;所述的同种皮肤组织源自健康儿童包皮环切术所切除的包皮组织。
[0037]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的方法和设备为本技术领域常规方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0038]进一步，如上所述的组织工程皮肤构建新方法，具体包括如下步骤:[〇〇39]表皮干细胞的分离和培养[〇〇4〇]取环状切除术后小儿包皮(家属知情同意)，将组织先后在碘伏与75%的乙醇中消毒，并在含1%抗生素的PBS中进行漂洗;剔除皮下脂肪层、血管、结缔组织，剪成lcm2小块， 置于3.3mg/ml dispasell中4°C消化14hr，机械分开表皮与真皮层。将表皮置于离心管中， 加入0 ? 25 %胰酶5ml，在37 °C孵箱中消化15min。加DMEM+10 %FBS终止消化，1500r/min X 5min，弃上清，加入无血清角化培养基，在斡旋器上瞬时震荡6次。70wii无菌滤网过滤，吸取单细胞悬液，3 X 106接种在已包被0.1 % I型牛胶原的培养皿中，置37 °C、体积分数为5 % C02 饱和湿度的培养箱中培养。待细胞长成70%?80%融和状态时，用Tryple消化细胞5min， PBS稀释消化液终止消化，吹打混悬，离心收集细胞，加培养基，转移至I型胶原包被好的培养皿内，继续培养至P2代，每两天换液，用作构建表皮的种子细胞。[〇〇411 I型牛胶原3D支架制备[0〇42] 准备接种前1天，制备3D牛胶原支架。胶原配置(10ml):7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM Hepes，0.1mLlM NaOH，配制在低温下进行，配制好后37°C条件下凝固30min。待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH。[〇〇43]接种表皮干细胞[〇〇44]次日，吸弃培养板中平衡溶液待用。获取培养至70%?80%融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种6 X 105细胞数量于24mm 的嵌套培养皿的上室中，上室中添加培养基(Cnt-07，CELLnTEC)2ml，下室中添加培养基 (Cnt-07，CELLnTEC) 3ml继续培养2天待细胞100 %汇合成片。
[0045]气液分离培养构建组织工程皮肤
[0046]更换添加MMPs抑制剂mar imas tat 5nM。的角质细胞分化培养基(Cnt_3D， CELLnTEC)继续培养2天。接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化培养基(Cnt-3D，CELLnTEC) 0.8mL，液面不高于表皮细胞层， 每天换液，至12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。[〇〇47]上述制备过程中所使用的表皮干细胞专用培养基为CELLnTEC公司的Cnt-07培养基；角化细胞分化专用培养基为CELLnTEC公司的Cnt-3D培养基并添加丽Ps抑制剂 marimastat 5nM〇[〇〇48]本发明的有益效果如下:本发明采用表皮干细胞作为种子细胞，利用I型牛胶原3D 支架结合CELLnTEC培养系统，能够维持表皮干细胞的增殖和分化，不使用成纤维细胞，解决了单纯表皮细胞在支架材料上增殖缓慢的缺点，并有效减少了人工表皮产品制备过程中的工作量和操作步骤。本发明利用通过分化培养基中添加MMPs抑制剂，有效减少了支架和人工表皮产品的收缩。【具体实施方式】
[0049][〇〇5〇]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0051]种子细胞的筛选与培养是构建组织工程皮肤重要的一步。表皮干细胞因其具有较大的增殖和分化潜能成为种子细胞的首选，但该细胞的特征之一是慢周期性，细胞的增殖速度较慢。以前的方法多数通过添加真皮成纤维细胞作为种子细胞促进表皮干细胞的增殖与分化。本发明只采用表皮干细胞作为种子细胞，CELLnTEC系统培养，解决了依赖真皮成纤维细胞的缺点。[〇〇52]支架材料是组织工程的第二要素，本发明采用同种无细胞胶原作为支架材料，既具备了良好的天然皮肤结构，为种子细胞提供良好的支架环境;又具备了良好的生物相容性和极低免疫原性，有效促进种子细胞的黏附与增殖。[〇〇53]组织构建是组织工程的关键技术，本发明采用气-液分离的方法，模拟人体在体条件，可有效构建组织工程皮肤。[〇〇54] 实施例1
[0055]表皮干细胞培养及分化各阶段培养基的组成及培养方法与结果 [〇〇56]方法:取环状切除术后小儿包皮(家属知情同意)，将组织先后在碘伏与75%的乙醇中消毒，并在含1%抗生素的PBS中进行漂洗;剔除皮下脂肪层、血管、结缔组织，剪成lcm X lcm小块，置于3.3mg/ml dispasell中4°C消化14hr，机械分开表皮与真皮层。将表皮置于离心管中，加入0.2 5 %胰酶5m 1，在37 °C孵箱中消化15min。加DMEM+10 % FBS终止消化， 1500r/min X 5min，弃上清，加入无血清角化培养基，在斡旋器上瞬时震荡6次。70wii无菌滤网过滤，吸取单细胞悬液，3 X 106接种在已包被0.1 % I型牛胶原的培养皿中，置37 °C、体积分数为5%C02饱和湿度的培养箱中培养。待细胞长成70%?80%融和状态时，用Tryple消化细胞5min，PBS稀释消化液终止消化，吹打混悬，离心收集细胞，加培养基，转移至I型胶原包被好的培养皿内，继续培养至P2代，每两天换液，用作构建复合皮的种子细胞和进行细胞鉴定(K19及p63免疫细胞化学染色鉴定)。[〇〇57]结果:采用CELLnTEC公司的角化细胞选择培养基能够很好的实现人包皮角化细胞的增殖和纯化。在原代3X106接种密度条件下，6-7天角化细胞能够生长至80%汇合，传代后，以IX 106密度接种，5天角化细胞能够生长至80%汇合，细胞传至2-3代增殖能力和纯度最佳，适合用于构建组织工程皮肤。此方法分离纯化的细胞具有角化细胞特征:呈铺路石样集落生长，免疫细胞化学染色结果显示，表达角化细胞标志角蛋白19和核蛋白p63,阳性细胞比例占90%以上(图1)。
[0058]实施例2
[0059]角质形成细胞代数、接种量、接种时间及气液界面培养角质化层形成的方法与结果[0〇6〇] 方法:准备接种前1天，制备3D牛胶原支架。胶原配置(10ml): 7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制好后37°C条件下凝固30min。待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH。次日，吸弃培养板中平衡溶液待用。获取培养至70 %?80 %融和状态的P2代角质形成细胞，接种6X105细胞数量于24mm的嵌套培养皿的上室中，上室中添加培养基(Cnt-07，CELLnTEC) 2ml，下室中添加培养基(Cnt-07，CELLnTEC) 3ml继续培养2天待细胞100 %汇合成片，更换角质细胞分化培养基(Cnt-3D，CELLnTEC)继续培养2天。第5天，将 24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化培养基(Cnt-3D，CELLnTEC)0.8mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天角化表皮结构形成。
[0061] 结果:按上述方法能够获得直径大于6cm的组织工程表皮，组织学结果证明其具有完整的基底细胞层、角质层以及3-5层的颗粒细胞和棘细胞层。免疫组化染色显示基底层细胞表达P63蛋白，颗粒细胞和棘细胞层表达角蛋白10,角质层表达AKH1。以上结果均证明我们获得了具有完整组织结构的组织工程表皮(图2)。[〇〇62] 实施例3[〇〇63] 免疫缺陷小鼠皮肤移植试验验证组织工程皮肤移植安全性及治疗效果 [〇〇64]方法:取6-8周，平均20g裸小鼠12只，雄性，采用随机数字法分为4组。[〇〇65] A组:皮肤损伤后，仅进行组织工程皮肤移植。[〇〇66] B组:皮肤损伤后，进行相同的包扎处理。
[0067]皮肤移植具体过程:动物麻醉后，于动物背部近颈侧靠近腹部一侧做直径12mm的圆形全层皮肤及肌筋膜的切除。创面覆盖同样大小的移植物，再用生物敷料贴于移植物上， 创可贴固定。术后观察至小鼠完全苏醒并能自由活动，分组放置常规饲养。术后大体情况观察:连续观察动物体温、饮食、活动等一般情况。手术后每只动物每天伤口拍照，观察创面愈合情况。皮肤活检取材，常规行苏木精-伊红染色，镜下观察创面愈合情况。
[0068]结果:裸鼠组移植皮肤存活完好，皮肤红润，愈合良好。移植后第3天，观察移植物贴合良好，证明皮肤移植模型构建成功。移植后第14天，各组创伤完全愈合，A组没有形成瘢痕结构，伤口愈合质量最好(图3,4)。移植后第60天时，皮片依旧存活良好，小鼠没有其他生理病变，说明组织工程皮肤移植对受体没有潜在安全性危害。[〇〇69]本发明构建所得的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，组织形态学显示该组织工程皮肤具有表皮的多层结构，表皮层中具有多层不同分化程度的细胞，达到了组织工程皮肤的形态学要求。
[0070]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:采用人表皮干细胞作为种子 细胞，以牛I型胶原构建的3D基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活 性的全层组织工程表皮，具体包括如下步骤:(1)表皮干细胞的分离和培养:取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispase II中浸泡过夜，冷消化分离 真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶 原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；(2)1型牛胶原3D支架制备:准备接种前1天，制备3D牛胶原支架，胶原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液10ml， lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM H印es，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制 好后37°C条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过 夜，平衡PH;(3)接种表皮干细胞:次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70 %?80 %融和状态的P2代角质形成 细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种6 X105细胞数量于24mm的嵌 套培养皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培养基2ml，下室中添加Cnt-07，CELLnTEC 培养基3ml继续培养2天待细胞100 %汇合成片；(4)气液分离培养构建组织工程皮肤:更换添加MMPs抑制剂marimastat 5nM，的角质细胞分化Cnt_3D，CELLnTEC培养基继续 培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添 加角质细胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基0.8mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天 角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。2.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:步骤(1)中 所述的Dispase II的浓度为3.3mg/ml，温度4°C，消化时间为16小时。3.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:步骤(2)中 所述的I型牛胶原的浓度为1.5mg/ml。4.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:步骤(3)中 所述的接种密度为6 X 105细胞数量于24mm培养面积，培养基为Cnt-07，CELLnTEC。5.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:步骤(4)中 分化Cnt-3D，CELLnTEC培养基液体培养2天，气液界面培养12天。6.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:步骤(4)中 培养基中添加MMPs抑制剂marimastat 5nM〇7.根据权利要求1所述的基于胶原制备组织工程表皮的方法，其特征在于:所述的同种 皮肤组织源自健康儿童包皮环切术所切除的包皮组织。
【文档编号】A61L27/60GK105963795SQ201610380784
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】魏军, 杨银学, 陈冬梅, 梁雪云, 刘淑丹, 杨婷婷, 李玉奎, 刘晓明
【申请人】宁夏医科大学总医院