一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。本发明中利用维生素C促进脂肪干细胞膜片形成，然后利用反复冻融法联合Triton×100脱细胞处理，构建一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。该材料表面平整，质地均一，细胞外基质含量丰富，形成孔隙样三维组织，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，无免疫原性，能自体移植，具有临床应用的可操作性。且其制备方法简单，十分具有实用价值。
【专利说明】
一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤手术、外伤或先天缺陷均可造成严重软组织缺损，临床常用修复方法包括人工材料填充和自体组织瓣移植，但这些方法存在组织相容性差、创伤大、移植物坏死吸收等局限性。随着组织工程技术的发展，组织工程有望成为一种新型且有效的修复方法。
[0003]细胞支架是组织工程的主要研究内容之一，起到支撑种子细胞和引导组织再生的作用。理想的支架材料应具有无免疫原性、可塑性强以及良好的生物相容性，迄今仍未找到一种理想细胞支架材料用于组织工程。人工高分子材料虽具有足够的机械强度和适当的降解速度，但免疫原性强，缺乏天然的细胞外基质，细胞识别位点不足，细胞亲和力较弱，且具有一定生物毒性。脱细胞基质材料可以克服上述缺陷，脱细胞技术是指通过化学和物理的方法去除异体或异种组织器官中的细胞成分，细胞外基质在经过去除细胞和可溶性蛋白处理后，可以维持正常组织基质成分，形成一种由胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹力蛋白组成的三维支架结构。另外，脱细胞支架保留了完整的血管网络结构，易于营养物质及氧气的运输，三维的细胞外基质结构为细胞的贴附和增殖提供了一个合适的生物环境。目前的脱细胞基质材料来源主要为异种动物筋膜组织和器官，已有商品化生产脱细胞基质产品，如猪小肠黏膜脱细胞基质材料(SIS) AIS是一种美国Π)Α批准的可生物降解的、无细胞的、异于胶原组织基质的移植物，取材于猪小肠黏膜脱细胞组织，已经用于疝、尿道狭窄等疾病临床治疗。然而，研究表明，异种来源脱细胞外基质成分移植后不仅在局部产生炎症反应，且仍具有一定的免疫原性，当异种脱细胞基质异体的胶原基质与宿主血液的接触可直接激活一系列免疫级联反应，产生免疫排斥，影响手术效果，甚至可引起患者死亡。
[0004]细胞膜片技术是上世纪90年代发展起来的一种组织工程新技术，该技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌，能完整的保留细胞外基质和细胞间连接，形成由一种由细胞和细胞外基质组成的致密膜片状组织。细胞膜片厚度与机械强度除了与培养基条件有关，还与细胞类型密切相关。当细胞活性和增殖能力越强，细胞膜片形成的速度和厚度明显提高。与成体细胞相比，干细胞活性和增殖能力明显更强。脂肪干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞，具有增殖能力强、来源广泛、取材方便、培养简单的特点，是一种常用组织工程种子细胞。目前常用的脱细胞方法包括渗透溶液法、去污剂法、酶消化法、细胞冻融法等，没有一种方法适用于所有脱细胞材料类型。理想的脱细胞方法要求既能完全去除供体细胞，降低免疫原性，又能保留天然胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分，以保持足够的机械强度。针对细胞膜片的构成特点，对细胞膜片脱细胞处理应谨慎选择，应避免细胞外基质成分破坏和降解。因此，区别于目前脱细胞基质材料来源，通过构建自体脂肪干细胞膜片，优化脱细胞方法，制备一种无免疫原性的脱细胞基质材料可用于机体软组织缺损修复和作为组织工程支架材料。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法。
[0006]本发明第一方面提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。
[0007]本发明第二方面提供了一种上述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008]步骤一:将脂肪干细胞高密度的接种于细胞培养皿中；
[0009]步骤二:在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，得到细胞膜片；
[0010]步骤三:将所述的细胞膜片反复冻融，并在脱细胞液中振荡后漂洗，得到漂洗后的脱细胞基质材料；
[0011]步骤四:将所述的漂洗后的脱细胞基质材料冻干处理，封装后灭菌，得到所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。
[0012]较佳地，所述的高密度为5 X 14个/cm2。
[0013]较佳地，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素进行刺激为以lOOyg/ml维生素C强刺激3天，更换50yg/ml维生素C温和刺激18天。
[0014]较佳地，所述的步骤三中反复冻融为在液氨和温水中反复冻融。
[0015]较佳地，所述的脱细胞液为Triton X-100脱细胞液。
[0016]较佳地，所述的步骤三中，采用PBS缓冲液进行漂洗。
[0017]本发明中利用维生素C促进脂肪干细胞膜片形成，然后利用反复冻融法联合TritonX 100脱细胞处理，构建一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。该材料表面平整，质地均一，细胞外基质含量丰富，形成孔隙样三维组织，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，无免疫原性，能自体移植，具有临床应用的可操作性。且制备方法简单，十分具有实用价值。
【附图说明】
[0018]图1A与图1B为脂肪干细胞及其表型鉴定图；
[0019]图2A和图2B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料HE染色比较图；
[0020]图3A和图3B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料扫描电镜比较图；
[0021 ]图4A和图4B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料I型胶原表达情况图；
[0022]图5A和图5B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料纤连蛋白表达情况图；
[0023]图6A和图6B为脱细胞基质材料与SIS分别移植皮下HE染色比较图。
【具体实施方式】
[0024]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
[0025]1、脂肪干细胞原代培养
[0026]比格犬，6-8个月，戊巴比妥全身麻醉后无菌切取腹股沟处1g脂肪组织，剔除肉眼可见筋膜及血管，0.25 %氯霉素浸泡30分钟，I3BS漂洗3遍，眼科剪尽量剪碎成肉沫状，加入
0.1 % I型胶原酶在37 0C中消化Ih，100目滤网过滤，300g离心5min，加入干细胞培养基重悬后接种于10mm细胞培养皿中继续培养，每2-3天更换培养基。
[0027]脂肪干细胞培养基组成:450ml低糖DMEM培养基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+100mg/ml硫酸链霉素，0.22μηι滤网过滤除菌。
[0028]如图1A所示，通过酶消化法和梯度贴壁原代培养脂肪干细胞，细胞呈现螺旋形梭形分布(Χ100)。
[0029]2.脂肪干细胞纯度鉴定
[0030]将原代培养脂肪干细胞传代至Ρ2，流式细胞仪鉴定其干细胞纯度，选取CD45、⑶90、⑶105作为表面抗原标志，0.25%胰蛋白酶+0.01 %EDTA消化后4%多聚甲醛固定15分钟，PBS清洗2遍，300g离心5min后加入250μ1 PBS重悬，分别加入2μ1 CD45-FITC抗犬抗体、Iμ? CD90-PE抗犬抗体、2μ1 CD105-FITC抗犬抗体，在4°C条件下避光孵育30分钟，PBS清洗2遍，上机检测。
[0031]如图1B所示，流式细胞仪鉴定干细胞纯度，其中⑶45阴性表达，CD90和⑶105阳性表达，证实其干细胞属性。
[0032]3.脂肪干细胞膜片制备
[0033]将P2代脂肪干细胞以5 X 104个/cm2接种于60mm细胞培养皿，待细胞融合至90%以上时，更换细胞培养基A继续培养，3天后更换细胞培养基B连续培养18天，每2天更换细胞培养液，培养3周即可成制备脂肪干细胞膜片，可直接用镊子轻轻撕下，大小约5X5cm。
[0034]细胞培养基A成分:450mL低糖DMEM培养基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+10mg/mL硫酸链霉素+100yg/mL维生素C+3.7g/L NaHCO3
[0035]细胞培养基B成分:450mL低糖DMEM培养基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+10mg/mL硫酸链霉素+50yg/mL维生素C+3.7g/L NaHCO3
[0036]4 J兑细胞
[0037]I)前期处理:连续培养3周至脂肪干细胞膜片形成，大小约5 X 5cm，PBS漂洗3次，每次3分钟，备用。
[0038]2)反复冻融处理:制备的细胞膜片首先在_196°C液氮和37°C温水中反复冻融3次，每次液氮冻存时间为30min，37°C温水中lOmin。
[0039]3)TritonX100脱细胞处理:置于l%Triton X-100脱细胞液中，常温下摇床振荡24h，振荡频率为 150-200r/min，具体脱细胞液配置:1mM Tris-HCl，1mM EDTA ,1% Tri tonX-100溶解于去离子水中，PH值为7.8。上述处理后，继续置于50ml PBS缓冲液中，摇床振荡漂洗24h，漂洗频率为100-150r/min。
[0040]4)杀菌消毒及包装:采用冷冻干燥机将上述脱细胞基质材料冻干处理并封装，C060 γ射线辐照灭菌，即得成品。
[0041 ] 5.脂肪干细胞膜片与脱细胞基质材料体外检测
[0042]I )ΗΕ染色:将脂肪干细胞膜片与脱细胞基质材料切片脱蜡入水后苏木素染色5分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗返蓝30分钟，伊红染色I分钟后乙醇梯度脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，正置显微镜下观察。
[0043]培养3周后收获膜片状物，如图2Α所示，脂肪干细胞膜片由6-8层细胞构成，厚度约90-110μπι，细胞之间紧密连接形成致密片状整体。脂肪干细胞膜片进行脱细胞处理后，如图2Β所示，脱细胞基质材料内部无明显细胞核残留，蛋白胶原纤维未挛缩和破坏，厚度约30-
6Oum ο
[0044]2)扫描电镜观察:连续体外培养3周至细胞膜片形成，按上述脱细胞方法脱细胞处理后，分别取Icm2细胞膜片及脱细胞基质材料样品，生理盐水清洗3遍，1.25%戊二醛4°C预固定2h，0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次15分钟，I %饿酸4°C固定2h，酒精梯度脱水，临界点干燥仪中干燥约2h，双面胶将干燥样品粘贴于样品台上，喷金3分钟，扫描电镜观察。
[0045]如图3A所示，细胞膜片表面平坦，纤维蛋白和胶原大量分布，并连接各细胞形成致密整体。如图3B所示，脱细胞基质材料内无细胞残留，呈现网格状多孔隙结构。
[0046]3)免疫组织化学分析:4%多聚甲醛将脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料固定12h，石蜡包埋，切片，55°C烘箱中过夜，脱蜡入水，柠檬酸钠(PH 6.0)溶液水浴煮沸30min抗原修复，5%BSA封闭常温30min，一抗(I型胶原1:800稀释，纤连蛋白I: 200稀释)4°C孵育过夜，PBS清洗5遍，HRP-二抗37°C孵育30min，DAB( 1:50)显色15分钟，终止后苏木紫复染，酒精梯度脱水后中性树胶封片。
[0047]免疫组化染色棕黄色为标记蛋白阳性表达，如图4A所示，脂肪干细胞膜片中I型胶原广泛分布，条索状无序排列；图4B中示脱细胞基质材料中I型胶原含量丰富；图5A示脂肪干细胞膜片中纤连蛋白广泛分布；图5B示脱细胞基质材料中纤连蛋白布满整个视野，胶原纤维结构完整。以上结果表明无论是脂肪干细胞膜片还是脱细胞基质材料中均包含丰富的细胞外基质成分-1型胶原和纤连蛋白，且脱细胞处理后未明显流失。
[0048]6.脱细胞基质材料与SIS皮下移植:
[0049]常规麻醉后，消毒铺巾，在比格犬腹股沟处切开2cm长度切口，分离皮下结缔组织，使其存在一个皮下间隙，将脱细胞基质材料2 X 2cm自体回植入皮下间隙处，同时将2 X 2cm大小SIS植入另一条比格犬皮下同等部位。移植I周后，将包围周围结缔组织的皮下移植物取出，HE染色评价中性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。
[0050]图6A示SIS移植后结构完整，区域内部大量中性粒细胞或淋巴细胞浸润。图6B示脱细胞基质材料移植后仅见极少量中性粒细胞或淋巴细胞浸润现象。
[0051]本发明提供的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法，完整保留细胞外基质成分，无免疫原性，能自体移植，可用于机体软组织缺损修复和作为组织工程支架材料。维生素C在细胞外基质形成过程中起着关键作用，可显著促进细胞胶原合成，形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构，在既往报道的细胞膜片构建中广泛使用。通过优化维生素C使用剂量，构建足够厚度和机械强度的细胞膜片。针对细胞膜片特性，选择最佳脱细胞方案。非离子去垢剂(TritonX 100)通过溶解脂质以增加细胞膜的通透性，进而破坏细胞膜，使细胞溶解，使细胞成分易溶，提高去除DNA效率，对胶原纤维和基质蛋白活性影响小，可以避免对细胞外基质中的蛋白成分造成严重损害。同时，采用反复物理冻融方法脱细胞对细胞外基质无损伤，能完整保留胶原和纤维结构，有利于非离子去垢剂渗入进行充分作用。最后，将这种脱细胞基质材料与商品化生产的SIS分别移植入皮下，HE染色观察对比两者中性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。
[0052]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料，其特征在于，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。2.—种根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:将脂肪干细胞高密度的接种于细胞培养皿中； 步骤二:在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，得到细胞膜片； 步骤三:将所述的细胞膜片反复冻融，并在脱细胞液中振荡后漂洗，得到漂洗后的脱细胞基质材料； 步骤四:将所述的漂洗后的脱细胞基质材料冻干处理，封装后灭菌，得到所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。3.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的高密度为5X 14个/cm2。4.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素进行刺激为以lOOyg/ml维生素C强刺激3天，更换50yg/ml维生素C温和刺激18天。5.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中反复冻融为在液氨和温水中反复冻融。6.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞液为Triton X-100脱细胞液。7.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中，采用PBS缓冲液进行漂洗。
【文档编号】A61L27/36GK105963785SQ201610458110
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】傅强, 周术奎
【申请人】上海市第六人民医院