一种组织工程表皮及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，特别涉及一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体面积最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。遗传疾病、烧烫伤、慢性皮肤创伤(如糖尿病)、白癜风、白化病等很多原因会对皮肤造成损害，影响皮肤美观、使皮肤留下疤痕甚至失去生理功能。当皮肤受到严重损害，如深度的大面积烧烫伤时，皮肤不能再进行自我恢复，会失去对细菌的抵御作用，导致大量细菌通过皮肤侵入人体，极易引发全身感染而导致死亡。
[0003]目前，最普遍的治疗皮肤烧烫伤的方法是采用手术移植人体自身其他部位没有损伤的皮肤至烧烫伤处，但是这种方法有很大局限性，具体体现在:首先，当皮肤大面积烧伤时，人体自身的正常皮肤来源有限；其次，移植后的皮肤存活率低，这也是临床上皮肤移植面临的重大挑战。
[0004]因此，利用体外培养技术来扩增皮肤细胞，在体外构建出组织工程皮肤，并通过组织工程皮肤移植来治疗皮肤创伤具有重要的意义。长期以来，皮肤学专家和皮肤科医生一直致力于具有生理功能的人类皮肤的再生研宄。组织工程表皮早在20多年前就用于大面积烧伤的治疗，对提高烧伤病人的成活率起着重要作用，但普通的组织工程表皮产品移植到人体后有很多局限性，如表皮易起水泡不平整、表皮容易过度增生，而且因为没有真皮细胞通常会造成疤痕的收缩，不能形成真正具有完整生理功能的皮肤。因此，目前人工组织表皮除了用于临时覆盖伤口降低死亡率之外，在临床上的应用还比较少。近几年组织工程全程皮(包含表皮和真皮)，即在体外用培养的表皮和真皮细胞结合胶原蛋白而形成的，引起了人们的重视。越来越多的此类产品进入临床应用于创伤愈合，并且获得了较好的疗效。然而，目前的组织工程全层皮的制备方法复杂，需要较长时间的培养才能形成皮肤结构，严重限制了其推广和应用。另外人工真皮在临床上也有应用，但由于不带有活性细胞而且没有表皮部分形成不了正常的皮肤，造成其应用的局限性。
【发明内容】
[0005]为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法简单、周期短，所得组织工程表皮可以与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成，可以形成带有毛发、皮脂腺、皮下脂肪等功能性的完整皮肤。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0007]本发明提供了一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，包括如下步骤:
[0008]步骤1:获得表皮细胞；
[0009]步骤2:接种所得表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80% -100%，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；所用混合培养基包含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；
[0010]步骤3:转移所得组织工程表皮至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；其中，表皮细胞层的分化细胞层与半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布接触；
[0011]步骤4:培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所得带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养lh-2h，即得；
[0012]其中真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。
[0013]在本发明中，真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种，其包含真皮成纤维细胞、成纤维细胞前体细胞、脂肪及脂肪前体细胞、毛乳头细胞、血管内皮细胞；或者从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种细胞和黑色素细胞的混合物。
[0014]本发明通过发明人大量的创造性劳动，意外发现在获得表皮细胞层之后，将表皮细胞层转移到半渗透性聚合物、或硅胶膜底物、或凡士林纱布上，获得带有表皮细胞层的膜，最后，加入真皮细胞通过较短时间的孵育，使真皮细胞完全附着表皮细胞，即得到了带有真皮细胞的组织工程表皮。本发明提供的制备方法简单、周期短，且所得组织工程表皮能够与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成。实验结果证实，当真皮细胞为真皮成纤维细胞与黑色素细胞的混合物时，所得的带有真皮细胞的组织工程表皮在移植动物之后，能够形成完整的皮肤结构，具有成熟毛囊、汗腺、皮脂腺，且具有自身愈合能力。
[0015]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中的真皮细胞具体为从皮肤真皮中分离的真皮细胞中的一种或几种细胞和黑色素细胞的混合物。
[0016]优选地，本发明提供的制备方法中，步骤I中表皮细胞的制备方法为:
[0017]取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育10h_20h，之后分离表皮，得表皮；
[0018]取所得表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮细胞。
[0019]在本发明中，表皮细胞的来源不受本发明提供的制备方法的限制，本领域技术人员能够根据实际情况购买或者制备表皮细胞。本发明中所用到的皮肤组织可以是任何皮肤组织，例如胚胎、新生儿或成人的任何皮肤组织。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，所用到的皮肤组织为成人包皮组织。
[0020]优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中的接种之前，还包括表皮细胞的传代培养；
[0021]接种所用的表皮细胞为Pl代表皮细胞、P2代表皮细胞或P3代表皮细胞。
[0022]在本发明中，Pl代细胞为原代分离的细胞传过I代之后的细胞；P2代细胞为原代分离的细胞传过2代之后的细胞；P3代细胞为原代分离的细胞传过3代之后的细胞。
[0023]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法，包括如下步骤:
[0024]步骤⑴:表皮细胞分离:
[0025](1-a)采集含有表皮的皮肤组织；
[0026](Ι-b)将所述皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；
[0027](1-c)将所述冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，(TC -40C消化孵育12h-20h ；
[0028](1-d)分离所述消化孵育后的长条状皮肤组织，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠状，制得表皮匀浆；
[0029](Ι-e)将所述表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37°C下消化25分钟-35分钟，制得表皮细胞悬液；
[0030](Ι-f)向所述表皮细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液；
[0031](Ι-g)过滤中和后的表皮细胞悬液，离心、收集沉淀，得表皮细胞；
[0032]步骤(2):所述表皮细胞的传代培养:
[0033]将所述表皮细胞作为初始细胞，接种，培养至密度达80% — 100%，进行传代；
[0034]所述传代操作具体包括:
[0035](2-a)将培养至密度达80% _100 %的表皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37°C下消化5分钟一 15分钟；
[0036](2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后，离心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含双抗的Fl2培养基重悬细胞后，离心分离，收集沉淀，得原代表皮细胞；
[0037](2-c)将所述原代表皮细胞按1:2-3的比例传代，所述传代次数为I代_5代；
[0038]步骤(3):组织工程表皮片培养:
[0039](3-a)铺所述Pl代表皮细胞、所述P2代表皮细胞或所述P3代表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50% -80%，然后加入表皮培养基培养；每隔一天更换新的所述表皮培养基;
[0040](3-b)当细胞密度达80% -100%后，将表皮培养基换成混合培养基；所述混合培养基含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基；
[0041](3-c)培养16-24小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗，之后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37°C下培养30分钟-45分钟，至表皮细胞成片分离下来，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；
[0042]步骤(4):所述组织工程表皮片转膜并结合真皮细胞:
[0043](4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗所述组织工程表皮片；
[0044](4-b)将所述清洗后的组织工程表皮片的基底细胞表面向下放置，将半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布放置在所述组织工程表皮片上面，之后将所述组织工程表皮片的边缘提起贴附在所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在半渗透性聚合物透气性半渗透性聚合物、或硅胶膜底物、或凡士林纱布上，制得带有表皮细胞层的膜；
[0045](4-c)培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，然后在37°C下培养I小时-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮；
[0046]其中真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。
[0047]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(1-c)中的中性蛋白酶酶液的浓度为2.5mg/mL。
[0048]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以g/mL计，步骤(1-e)中所用的含胰酶的磷酸盐缓冲液中胰酶的浓度为0.05% ；
[0049]每5g所述表皮匀浆加入20mL所述含胰酶的磷酸盐缓冲液。
[0050]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以体积百分比计，步骤(Ι-f)中所述含胎牛血清的DMEM培养基中