，所述胎牛血清的含量为5% -10% ；
[0051]向所述表皮细胞悬液中加入与所述表皮细胞悬液体积相同的所述含胎牛血清的DMHM培养基。
[0052]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(2)中表皮细胞的培养方法具体为:
[0053]将所述表皮细胞置于含Rho激酶抑制剂的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将所述表皮细胞悬液接到铺有胶原蛋白的培养皿中培养。
[0054]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(2-b)中含双抗的F12培养基中的双抗为青霉素和链霉素溶液的混合液；
[0055]其中，所述青霉素的浓度为100U/mL，所述链霉素的浓度为100ug/mL。
[0056]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(3-b)中的混合培养基中，胎牛血清的体积为DMEM培养基和F12培养基体积之和的0.1 %。在本发明的另外一些实施例中，混合培养基中，DMEM培养基和F12培养基的体积比为3:1。
[0057]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(4_b)中的半渗透性聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤(4-b)中的半渗透性聚合物具有孔径位3.0 μπι的透气性孔。
[0058]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞的制备方法为:
[0059]取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育12h_20h，之后分离真皮，得真皮；
[0060]取所得真皮，切碎后，用I型胶原酶酶解，收集，即得真皮细胞。
[0061]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，当真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞时，步骤4中培养真皮细胞的方法具体为:
[0062]将真皮细胞直接铺板，细胞密度为200-300万/皿，用含20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL成纤维细胞生长因子的1:3DMEM/F12混合培养基进行培养，培养温度为30 0C -40 0C ο
[0063]在本发明中，表皮细胞和真皮细胞可以来自于同一皮肤组织，也可以来自不同的皮肤组织。本领域技术人员可以根据实际情况选择皮肤细胞、真皮细胞的来源和组合。在本发明的一些实施例中，表皮细胞和真皮细胞来源于同一皮肤组织。
[0064]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法，包括如下步骤:
[0065](I)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养:
[0066](1-a)采集含有表皮和真皮的皮肤组织；
[0067](Ι-b)将采集的皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；
[0068](Ι-c)将冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，冷消化孵育过夜；
[0069](1-d)将孵育过夜的长条状皮肤组织的表皮和真皮分离，并将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；
[0070](Ι-e)将表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37°C下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37°C下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；
[0071](Ι-f)向消化完的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分别加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液；
[0072](Ι-g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100 μm的过滤筛网过滤后，用离心分离法将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来；
[0073](Ι-h)将分离得到的表皮细胞和真皮细胞即元代细胞分别接种并用不同培养基中培养；元代细胞培养5-10天达到80% — 100%满进行传代。
[0074](2)表皮细胞和真皮细胞传代:
[0075](2-a)将步骤(Ι-h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，分别浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37°C下消化5 - 15分钟；
[0076](2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DiffiM培养基中和后使用离心分离法分离一次，向分离得到的表皮细胞和真皮细胞中分别加入含双抗的F12培养基重悬细胞后再次使用离心分离法分离；
[0077](2-c)将分离好的表皮细胞按1:2-3的比例传代，真皮细胞按1:5_10比例传代；通常传1-5代进行冰冻保持或用于步骤(3)和4(c)。
[0078](3)组织工程表皮片培养:
[0079](3-a)铺Pl或P2或P3的表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50-80 %，Pl细胞为原代分离的细胞传过I代之后的细胞，P2为传过两代的细胞，P3为传过三代的细胞，然后加入表皮培养基(培养，每隔一天更换新的表皮培养基；(3-b)当细胞长满后，将原表皮培养基换成含胎牛血清的3:1DMEM/F12混合培养基；
[0080](3-c)培养16-24小时后，将表皮细胞用磷酸盐缓冲液冲洗后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37°C下培养30-45分钟，至表皮细胞成片分离下来形成表皮细胞层；
[0081](4)表皮细胞层转膜并结合真皮细胞:
[0082](4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗表皮细胞，不要损伤细胞层，每次清洗时留取少量DMEM培养基，使表皮细胞层漂浮于DMEM培养基表面；
[0083](4-b)使清洗后的表皮细胞层基底细胞表面向下放置，将要转移的带有3.0 ym透气孔径的半渗透性聚合物(如聚对苯二甲酸乙二醇酯膜)或硅胶膜底物或凡士林纱布放置在表皮细胞层上面，将表皮细胞层的边缘提起贴附在膜上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在膜上，制得带有表皮细胞层的膜；
[0084](4-c)将带有表皮细胞层的膜转移到培养皿中，取步骤(2-c)中培养好的真皮细胞溶于F12培养基或DMEM培养基或其它相似的培养基。后，均匀铺在膜上的表皮细胞层上，然后在37°C下培养1-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮。
[0085]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，当步骤(4)中的真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物时，步骤(4-c)具体为:
[0086]将培养好的从皮肤真皮中分离的真皮细胞与黑色素细胞混合后溶于F12培养基中制得细胞悬液后，铺在带有表皮细胞层的膜上的表皮细胞层上，然后在37°C下培养I小时-2小时，使从皮肤真皮中分离的真皮细胞与黑色素细胞完全附着表皮细胞上，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮。
[0087]本发明具有如下有益效果中的至少一个:
[0088](I)本发明利用体外培养表皮细胞来形成组织工程表皮片，并结合真皮细胞后制得带有真皮细胞的组织工程表皮，所得组织工程表皮可直接用于移植，移植受体为人或者动物。当移植到皮肤创伤部位后，本发明提供的组织工程表皮可与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导，促进受体完整表皮结构的形成，最终再生出具有完整功能的皮肤。
[0089](2)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法操作简单，周期短，更有力于组织工程表皮的制备、推广和应用。
[0090](3)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法只需获得极少的健康皮肤组织就可以体外增殖出大量的表皮细胞、真皮细胞，进而用于制备带有真皮细胞的组织工程表皮，所得的组织工程表皮不存在免疫排斥反应，大大提高了移植成功率，也缩短了治疗时间。
[0091](4)当采用含有两种或两种以上真皮细胞制备带有真皮细胞的组织工程表皮时，所得的组织工程表皮移植后可以形成带有毛发、和/或皮脂腺、和/或皮下脂肪等功能性的完整皮肤。
[0092](5)本发明提供的带有真皮细胞的组织工程表皮可以用于建立特殊皮肤疾病模型，如牛皮癣、皮肤癌、湿瘆、斑秃、表皮水泡病、粉刺、白化病、皮肤老化等，也可以用于开发细胞产品用于临床上治疗白癜风、牛皮癣或皮肤白化病等，为人类多种皮肤疾病的治疗提供了崭新的途径。
【附图说明】
[0093]图1示移植6个月后裸鼠身上再生皮肤和毛发的照片；
[0094]图2示图1的再生皮肤的组织切片图。
【具体实施方式】
[0095]本发明公开了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，使用该方法，制备获得该组织工程表皮，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员而言是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及其应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0096]本发明提供的一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
[0097]下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此，实施例中的制备方法均为常规制备方法，不再详述。
[0098]实施例
[0099]带有真皮细胞的组织工程表皮的制备
[0100](I)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养:
[0101](1-a)采集胎儿头皮、新生儿包皮含有表皮细胞和真皮细胞的皮肤组织；(Ι-b)将采集的皮肤组织用酒精消毒处理3分钟后用含2倍双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)处理2次，每次3分钟，然后将皮肤组织于含I倍双抗的F12培养基中在4°C下保存备用，皮肤组织的保存时间不超过72小时；
[0102](Ι-c)将皮肤组织从培养基中...